… basé BactoScan FC, qui utilise du bromure d’éthidium pour colorer les bactéries dans le lait, fournit un résultat après 8 min (5, 30). Une technique cytométrique en flux pour mesurer le CBT dans du lait cru et à très haute température avec la tache SYTO BC a également été décrite précédemment (16). Cependant, ces techniques sont soit très spécifiques, détectant une seule espèce, soit non spécifiques, détectant toutes les bactéries., Les techniques cytométriques en flux pour la différenciation des bactéries dans le lait en groupes plus importants tels que les bactéries gram-positives et gram-négatives n’ont pas encore été décrites. La coloration de Gram a été initialement décrite en 1883 par le collègue de Christian Gram, Carl Friedlander, divisant les bactéries en deux groupes, et à nouveau en 1884 par Christian Gram (12, 14). La procédure conventionnelle de coloration de Gram comprend les taches crystal violet et safranin. Les cellules thermo-fixées sur une lame sont colorées en bleu-violet avec du violet cristal, puis traitées avec de l’éthanol., Les bactéries à Gram négatif sont décolorées par l’éthanol, tandis que les bactéries à gram positif restent colorées avec du violet cristallin. Par la suite, la safranine est utilisée pour lutter contre les bactéries gram – négatives, donnant à ce groupe un aspect rose. De nombreuses approches alternatives pour identifier la réaction de Gram ont été rapportées. Une méthode dans laquelle une colonie de bactéries est soumis à 3% d’hydroxyde de potassium est largement utilisé. La forte concentration d’hydroxyde de potassium lyse les bactéries gram-négatives, libérant de l’ADN des cellules, ce qui peut être confirmé en tirant une ficelle visqueuse de la colonie (15, 26)., Une technique alternative de coloration de Gram avec une lectine conjuguée à la fluorescéine agglutinine de germe de blé (WGA) pour l’épifluorescence combinée et un microscope à contraste de phase a été décrite (29). WGA se lie à la N-acétylglucosamine dans la couche de peptidoglycane de la paroi cellulaire. Les bactéries à Gram négatif ont une couche de lipopolysaccharide couvrant la paroi cellulaire et c’est pourquoi elles ne sont pas colorées avec WGA, alors que les bactéries à gram positif sont colorées avec WGA, car elles n’ont pas de couche de lipopolysaccharide., Ces résultats ont montré une insensibilité à l’âge de la culture, ce qui impliquait que cette tache pouvait être utilisée directement sur des échantillons sans précultivation de l’échantillon. Une version modifiée de la technique WGA a été décrite pour des bactéries trouvées dans un environnement non alimentaire dans lequel les bactéries sont immobilisées sur un filtre, lavées, puis colorées avec WGA (11). Certaines techniques de coloration de Gram pour la cytométrie fl ow ont également été proposées. On utilise la tache lipophile fluorescente rho-damine 123, qui colore sélectivement les bactéries gram-positives., La couche de lipopolysaccharide de bactéries gram-négatives pré-évacue l’entrée de rhodamine 123 (1, 28). Une autre technique similaire combine les deux taches de liaison à L’ADN fluorescentes, SYTO 13 et l’iodure d’hexidium (HI). SYTO 13 est une tache perméable à la membrane, et HI est bloqué par la couche de lipopolysaccharide de bactéries gram-négatives et donc seulement perméable aux bactéries gram-positives et aux bactéries gram-négatives avec une couche de lipopolysaccharide stabilisée (22). Cependant, en raison de la nature fragile de la couche de lipopolysaccharide, on pense que ces techniques ne conviennent pas aux échantillons non cultivés., Le but de ce travail a été de développer une technique de coloration de Gram basée sur la coloration de bactéries avec WGA et HI et suivie d’une détection cytométrique fl ow. La technique a été évaluée sur des bactéries associées au lait (19, 20) en phase sta – tionnaire et après 6, 12 et 48 h d’incubation en milieu labo – ratoire. En outre, la méthode a été testée sur des cultures en phase station qui avaient été stockées pendant 24 h à Ϫ 18 ° C et pendant 14 jours à 5 ° C. Enfin, la technique a été appliquée à du lait en vrac enrichi de bactéries connues., Une technique de différenciation des bactéries gram-positives et gram-négatives dans le lait en vrac sans précultivation sera l’application ultime. La Figure 1 montre l’effet de la concentration de KCl sur la liaison de WGA aux bactéries gram-positives M. luteus et S. uberis , lorsque les bactéries sont colorées par WGA seul, à l’exclusion de HI. Dans les histogrammes, le bruit est visible à gauche, où des événements à faible intensité de fluorescence se sont accumulés (un thresh – old a été utilisé pour couper la plupart du bruit)., Lorsque les bactéries sont souillées de manière suf fi cace pour les distinguer du bruit, elles apparaissent comme un pic entièrement séparé du bruit. En utilisant 0 M KCl, aucune des deux bactéries n’était assez colorée pour les séparer du bruit. En utilisant 1 M de KCl, on a observé une augmentation de l’intensité des bactéries. M. luteus a ensuite été séparé du bruit et S. uberis n’a que légèrement exagéré le bruit. L’augmentation de la concentration de KCl à 3 M a encore amélioré la liaison (intensités de fluorescence plus élevées) de WGA à ces souches de bactéries, en particulier pour M. luteus ., Les observations microscopiques ont démontré que les bactéries gram-positives étaient colorées par le WGA, alors que les bacte-ria gram – négatives n’étaient pas colorées par le WGA. Salut a taché à la fois les bactéries gram – positives et les bactéries gram-négatives. La Figure 2 montre un exemple de coloration d’un mélange (1:1) de M. luteus à gram positif et D’E. coli à gram négatif avec WGA et HI. À la suite de la coloration, M. luteus est apparu avec une surface verte (WGA) et un cytoplasme rouge (HI), alors Qu’E. coli n’est apparu qu’avec un cytoplasme rouge. Tracés isométriques des analyses Cyto – métriques des cultures D’E. coli, M., luteus, et un mélange (1: 1) de ceux-ci sont représentés sur la Fig. 3. Mesure d’E. coli seul (fig. 3A), 100% des événements étaient présents dans la région gram-négative. Pour M. luteus seul (fig. 3B), 99% des événements étaient dans la région gram-positive et 1% des événements sont entrés dans la région gram-négative. Lorsque les cultures D’E. coli et de M. luteus ont été mélangées (fig. 3C), 50% des événements ont été observés dans chaque région. Chacun des 12 souches bactériennes a été mesurée en double après 6,12, 24 et 48 h d’incubation. À partir de chaque mesure, 100 événements ont été utilisés pour les calculs. Dans La Fig., 4 une parcelle assemblée est présentée qui comprend les 800 événements pour chacune des 12 souches bactériennes testées pendant 48 h d’incubation (soit un total de 9 600 événements). Chaque souche bactérienne est présentée avec une couleur distincte. Une meilleure ligne calculée pour séparer les bactéries gram-positives et gram-négatives est montrée. Dans l’ensemble, la ligne a permis d’interpréter correctement 97% des événements. Les pourcentages de cellules correctement interprétées pour les souches individuelles ont été calés et sont présentés dans le tableau 1. Pour E. cloacae , E. coli , K. ocytoca , L. lactis, M. luteus, S. aureus, S. agalactiae, S., dys-galactiae et S. uberis , presque toutes les cellules ( Ͼ 96%) ont été correctement interprétées pour n’importe quel temps d’incubation. Pour B. cereus , P. fl uores – cens et P. putida , Ͼ 93% des cellules ont été interprétées de manière cohérente après 12 et 24 h d’incubation, alors qu’après 6 et 48 h d’incubation, seules 75 à 89% des cellules ont été interprétées correctement. Le tableau 2 présente les résultats des analyses cytométriques de cultures soumises à différentes conditions de stockage., Lorsque les cultures ont été stockées à 5 ° C pendant 14 jours, la technique de coloration semblait être en fonction de l’âge de la culture, en particulier pour les bactéries gram-négatives. Le pourcentage moyen de cellules correctement interprétées était de 86%. Pour E. coli, M. luteus , S. agalactiae , S. dysgalactiae et S. uberis , la plupart des cellules ( Ͼ 97%) ont été correctement interprétées. Pour B. cereus , E. cloacae , K. ocytoca , L. lactis et S. aureus , 76 à 89% ont été correctement interprétés, et pour P. fl uorescens et P. putida , les taux étaient respectivement de 58 et 68%., La congélation ne semblait pas appliquer la technique de coloration. Après stockage à Ϫ 18 ° C pendant 24 h, Ͼ 98% des cellules ont été interprétées correctement pour E. cloacae , E. coli , K. oxy – toca , L. lactis , P. putida , S. aureus , S. agalactiae , S. dysgalactiae et S. uberis . Pour B. cereus et P. fl uorescens , les taux étaient respectivement de 83 et 82%. La Figure 5 montre les diagrammes isométriques des anales cytométriques de S. aureus et D’E. coli ajoutées au lait en vrac. Pour S. aureus (fig. 5A), 98% des événements étaient dans la région gram-positive et 2% des événements sont entrés dans la région gram-négative., Pour E. coli (fig. 5B), 96% des événements étaient dans la région gram – négative et 4% des événements sont entrés dans la région gram-positive. La contribution des bactéries naturelles présentes dans le lait représentait moins de 0,1%. L’ajout d’une forte concentration de KCl à la solution de coloration a amélioré la capacité du WGA à colorer les bactéries à gram positif. Une explication possible est que les bactéries à gram positif ont des acides teichoïques attachés perpendiculairement à leurs parois cellulaires, ce qui, pour certaines bactéries à gram positif, peut bloquer l’accès du WGA à la paroi cellulaire., Lorsque la concentration de KCl est faible, la structure des acides teichoïques est rigide, mais en augmentant la concentration de KCl, la structure sera desserrée à mesure que les ions potassium élimineront les charges négatives sur les acides teichoïques, provoquant l’effondrement de la structure (8, 9). La composition et la structure des acides teichoïques varient entre les espèces gram-positives (24), ce qui peut expliquer pourquoi une augmentation de la concentration en KCl de 1 à 3 M a eu un effet plus important sur M. luteus que sur S. uberis . Dans le présent travail, 3 M de KCl ont été utilisés pour maximiser la liaison du WGA aux bactéries gram-positives., Les Techniques d’élimination de l’organisation des acides teichoïques n’ont déjà été rapportées que pour des applications microscopiques. Ces techniques comprennent l’utilisation de la fi xation du tétroxyde d’osmium par addition et évaporation d’acétone (2) et la fi xation thermique de bactéries sur une lame microscopique (29). Cependant, ces traitements n’ont pas pu être pris en compte dans la présente étude, car une étape de déshydratation n’est pas adaptée à la cytométrie Flo., La technique de coloration par Gram a montré des résultats fiables pour toutes les souches après 6, 12, 24 et 48 h d’incubation, pour lesquelles presque toutes les cellules (97%) ont été correctement interprétées. Ces résultats concordent avec les résultats de la méthode de coloration de Gram de la WGA…