suero fetal de la pantorrilla carbón-pelado (Véase también Ref. 3)
1
añadir 250 mg de carbón y 25 mg de dextrano T-70 a 100 ml de suero fetal de ternera (FCS).
2
incubar a 56 ° C durante 30 min.
3
centrifugar a 3000-4000 rpm durante 30 min a temperatura ambiente.
4
transfiera el sobrenadante a cubos nuevos.
5
Repita los pasos anteriores.
6
filtrar el sobrenadante a través de un prefiltro (tipo AP; Millipore, Bedford, MA) para eliminar el carbón.
7
filtrar la solución a través de un 0.,Filtro de tamaño de poro de 45-μ m (Flowpore, 64-002-04; ICN Biomedicals, Ltd.).
8
almacenar alícuotas a -20°C.
gelatina (10 × Stock)
1
hacer una solución al 1% (P/v) de gelatina (G-2500; Sigma, St.Louis, MO)
2
Autoclave durante 20 min.
3
Almacenar a 4°c.
platos/botellas recubiertos de gelatina
1
diluir el caldo de gelatina 10 veces.
2
pipeta esta solución en los platos para cubrir la superficie del plato completamente (1,5 a 2 ml por plato de 6 cm).
3
dejar los platos durante 2 horas a temperatura ambiente. Para acelerar este procedimiento se pueden colocar en la incubadora a 37°C durante 1 hora.,
4
aspirar los platos.
5
envuelva los platos en papel de aluminio y guárdelos a temperatura ambiente o a 4°C.
HEBS buffer (10× stock)
1 2
agregue agua doble destilada a 975 ml.
3
ajustar el pH a 7,05 y el volumen a 1000 ml.
4
Autoclave la solución y guárdela a 4°C.
5
antes de su uso, se agrega una solución de glucosa filtrada al tampón (ver preparación de 2× HEBS).
HEBS (2×)
1
diluir el caldo de HEBS 10× cinco veces con H2O estéril.
2
Añadir 0,2 ml de una solución de glucosa filtrada (1 g/ml) por 100 ml (concentración final, 10 mM).,
3
Ajuste el pH a 7.05-7.08. Este paso es crucial para la formación del complejo CA-ADN.
4
Esterilizar la solución por filtración.
solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin calcio y magnesio (14200-067 M; GIBCO, Grand Island, NY)
CaCl2 (2.5 M)
medio
medio Normal: preparado con FCS no inactivado con calor y medio con rojo fenol
medio empobrecido con esteroides: preparado con FCS pelado con carbón y medio sin Rojo fenol. Este medio solo se utiliza cuando se va a probar el efecto de las hormonas, normalmente presentes en el suero.,
cantidad de plásmido utilizado por transfección
plásmido Reportero constructo, 6.5 µg
Vector de expresión, 1.0 µg
plásmido de expresión como control para la eficiencia de transfección, 0.5 µg
Cuando la cantidad total de ADN es inferior a 8 a 10 µg, se debe agregar ADN portador (plásmido o ADN de esperma de arenque) para obtener un buen precipitado de Ca–ADN
buffer de lisis