Sistema bioluminiscente genéticamente codificable de hongos

• bioluminiscencia
• biosíntesis de luciferina fúngica
• luciferasa fúngica

la bioluminiscencia es un fenómeno natural de emisión de luz resultante de la oxidación de un sustrato, luciferina, catalizada por una enzima, luciferasa. Una variedad de especies son de naturaleza bioluminiscente (1); para muchas de ellas, la capacidad de emitir luz es una característica definitoria de su biología (2⇓-4). La integración Artificial de reacciones bioluminiscentes naturales en sistemas vivos también se ha convertido en una herramienta de reporte ampliamente utilizada en Biología molecular y Celular (5, 6)., Sin embargo, los sistemas bioluminiscentes naturales permanecen pobremente caracterizados a nivel bioquímico, limitando una aplicación más generalizada. Solo se han descrito 9 familias de genes de luciferinas y 7 de luciferasas (7, 8) de al menos 40 sistemas bioluminiscentes que se cree que existen en la naturaleza (9). Lamentablemente, solo se ha descrito en su totalidad una única cascada bioquímica a partir de un metabolito generalizado a una luciferina (10). La vía descrita es bacteriana y tiene una aplicación limitada en eucariotas (11)., Ninguno de los sistemas bioluminiscentes eucariotas ha sido descrito con suficiente detalle para ser expresado en otro organismo o para crear organismos bioluminiscentes artificiales de forma autónoma. Aquí describimos la función y evolución de los genes clave responsables de la bioluminiscencia del hongo Neonothopanus nambi y mostramos que la expresión de genes fúngicos es suficiente para diseñar eucariotas bioluminiscentes de forma autónoma.

aproximadamente 100 especies de hongos del orden Agaricales emiten luz utilizando la misma reacción bioquímica (12)., Aunque el papel ecológico de su bioluminiscencia no se entiende completamente, hay evidencia de que podría ser utilizado por los hongos para atraer insectos que distribuyen esporas (13). Se sabía que la bioluminiscencia fúngica utilizaba al menos cuatro componentes: oxígeno molecular; la luciferina, que recientemente se identificó como 3-hidroxihispidina ; y dos enzimas clave no descritas previamente, una hidroxilasa dependiente de NAD(P)H y una luciferasa (15, 16).

para identificar enzimas de la vía bioluminiscente fúngica, primero nos enfocamos en el aislamiento del gen de la luciferasa. Expresando la N., en Pichia pastoris y rociando placas de agar con 3-hidroxihispidina sintética, identificamos y secuenciamos una colonia de levadura luminiscente que expresaba el gen de la luciferasa (Apéndice SI, Figs. S1 y S13). La luciferasa N. nambi, nnLuz, es una proteína 267-aa(Apéndice SI, Fig. S2) y no tiene homólogos descritos o similitud de secuencia pronunciada con dominios proteicos conservados, representando una nueva familia proteica.

Los Genes que codifican enzimas que sintetizan metabolitos secundarios a menudo se agrupan en genomas fúngicos (17)., Planteamos la hipótesis de que este podría ser el caso de las enzimas de la cascada bioluminiscente, porque se cree que la cascada se conserva entre los hongos bioluminiscentes (12). Por lo tanto, buscamos genes relacionados con la biosíntesis de luciferina en las proximidades del gen de la luciferasa en el genoma de N. nambi. Además de N. nambi, también secuenciamos genomas y transcriptomas de hongos bioluminiscentes Neonothopanus gardneri, Mycena citricolor y Panellus stipticus y los comparamos con secuencias genómicas disponibles públicamente de hongos bioluminiscentes y no bioluminiscentes (18, 19)., Encontramos que la luciferasa es un miembro de un grupo de genes conservados, que incluye al menos otros dos genes: h3h e hisps (Fig. 1 B y C y conjuntos de datos S1 A S3).

el gen h3h mostró similitud de secuencia con 3-hidroxibenzoato 6-monooxigenasas, enzimas que catalizan la oxidación de 3-hidroxibenzoato usando NADH y oxígeno molecular. Esta reacción es idéntica a la que convierte hispidina en luciferina (Fig. 1A); por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el gen h3h codifica para hispidin-3-hidroxilasa (H3H), la enzima correspondiente a la hidroxilasa predicha (15)., Clonamos el gen de N. Nambi y encontramos que las colonias de P. pastoris que expresan nnluz y nnh3h emiten luz cuando se rocían con hispidina precursora de luciferina, a diferencia de las colonias de control que expresan nnluz solo (Apéndice SI, Figs. S14 y S17) – confirmando que nnh3h convierte hispidina en luciferina.

el gen hisps (Fig. 1C) codifica a un miembro de la familia de la poliquetida sintasa, enzimas que producen metabolitos secundarios en una variedad de organismos a través del árbol de la vida (20)., Por lo tanto, la naturaleza α-pirona de la hispidina sugiere que su biosíntesis puede ser realizada por una poliquetida sintasa del ácido cafeico por dos ciclos de adición de unidades malonil seguidas de lactonización (Fig. Apéndice 1A y SI, Fig. S3). Las grandes poliquetidas sintasas modulares requieren modificaciones postraduccionales para su actividad (21), como la transferencia de un grupo fosfopanteteinilo a un residuo de serina conservado del dominio de la proteína portadora de acilo., Para probar si el gen hisps puede producir precursor de luciferina en un sistema heterólogo, integramos los genes hisps, nnluz y nnh3h junto con el gen Npga de la 4′-fosfopanteteinil transferasa de Aspergillus nidulans en el genoma de P. pastoris. Cuando se cultivan en un medio que contiene ácido cafeico, las levaduras que expresan los cuatro genes emiten luz vista a simple vista (Fig. 3A), mientras que no se observó una producción significativa de luz en cepas que carecen de genes npga o hisps (Apéndice SI, Figs. S15 y S17)., Por lo tanto, hisps cataliza la síntesis de hispidina a partir del ácido cafeico, cerrando la cadena de reacciones (el «ciclo del ácido cafeico») de un metabolito celular común con biosíntesis conocida a una luciferina eucariótica.

en algunas especies bioluminiscentes de hongos, el cúmulo genómico aloja uno o dos genes adicionales (Fig. 1C): uno perteneciente a la familia del citocromo P450, y el otro perteneciente a la familia de las fumarilacetoacetato hidrolasas., Este último (cph) probablemente codifica una hidrolasa de cafeilpiruvato (conjunto de datos S4) involucrada en el reciclaje de oxiluciferina, consistente con cafeilpiruvato, la oxiluciferina fúngica, siendo hidrolizada a cafeato y piruvato por una hidrolasa presente en extractos fúngicos crudos (22).

la conservación del grupo genético sugiere que, a diferencia de otros grupos de organismos bioluminiscentes (23), la bioluminiscencia evolucionó en hongos solo una vez, con genes luz, h3h e hisps emergiendo a través de duplicaciones génicas. Árboles filogenéticos reconstruidos para los genes luz, h3h y hisps (Apéndice SI, Figs., S4-S6) y la especie árbol del orden Agaricales (Fig. 2) revelar la evolución de la cascada de bioluminiscencia en hongos. La enzima luz primaria de la cascada de bioluminiscencia fúngica emergió a través de una duplicación génica en la base de Agaricales seguida por la duplicación de h3h y hisps unos pocos millones de años más tarde. Curiosamente, muchas especies en un clado grande que codifica el hisps no son bioluminiscentes, y los homólogos de hisps en especies bioluminiscentes carecen de dos dominios, Los dominios cetoreductasa y deshidratasa (Apéndice SI, Fig. S6)., Es probable que la pérdida de estos dominios funcionales en el ancestro común de las especies bioluminiscentes favoreciera la producción de α-pironas por los hisps ancestrales, posiblemente proporcionando el paso final para la aparición de la bioluminiscencia.

El grupo de genes continuó evolucionando de forma dinámica, después de la adquisición de la bioluminiscencia. Al menos seis eventos independientes de pérdida génica completa o parcial de genes del cúmulo genómico llevaron a la pérdida secundaria de bioluminiscencia (Fig. 2). El gen cph fue insertado en el clado no ciclenoide, posiblemente dos veces (Fig. 1)., Este patrón mosaico se asemeja a la historia evolutiva de las proteínas fluorescentes (24), otra familia de proteínas visualmente relevante con un papel biológico poco claro, y puede indicar que la ventaja selectiva proporcionada por la bioluminiscencia en hongos depende de un contexto ecológico específico o transitorio.

Las adaptaciones complejas pueden ser una fuente de soluciones biotecnológicas relevantes., Además de revelar la naturaleza de los procesos fotoquímicos básicos y la evolución de las proteínas, las luciferasas se encuentran entre los principales tipos de genes reporteros utilizados en varias tuberías de investigación, métodos de diagnóstico y aplicaciones ambientales (5, 6, 25). Para determinar si una vía bioluminiscente fúngica puede proporcionar genes reporteros, caracterizamos nnLuz in vitro y probamos su capacidad para producir luz en sistemas heterólogos.

la proteína nnLuz consta de 267 aminoácidos y tiene una masa molecular de aproximadamente 28,5 kDa (Apéndice SI, Fig. S7)., Aunque su localización celular in vivo sigue siendo desconocida, la proteína tiene una hélice transmembrana N-terminal predicha, consistente con la colocalización de la actividad de la luciferasa con fracciones celulares insolubles en estudios previos (22). Cuando se expresa en P. pastoris, nnLuz se asoció con la fracción microsomal (Apéndice SI, Fig. S8) y luz verde emitida con un máximo a 520 nm y espectro idéntico al del micelio de N. nambi (Fig. Apéndice 3A y SI, Fig. S9). El nnluz recombinante emite luz de forma óptima a un pH aproximado de 8.,0 y temperaturas moderadas, perdiendo su actividad a temperaturas superiores a 30 °C (Apéndice SI, Fig. S10).

para probar el potencial de nnluz como gen reportero en sistemas heterólogos, probamos su expresión en Escherichia coli, P. pastoris, embriones tempranos de Xenopus laevis y células humanas., Aunque la luciferasa se acumuló principalmente en los cuerpos de inclusión cuando se expresa en bacterias (Apéndice SI, Fig. S7), todas las células y organismos probados que expresaban nnluz de tipo silvestre eran claramente bioluminiscentes cuando se añadió 3-hidroxihispidina al medio (Fig. 3 And si Appendix, Figs. S11 y S22). También comparamos nnluz cualitativamente con la luciferasa de la luciérnaga Photinus pyralis en una configuración de imágenes de todo el cuerpo de xenoinjertos tumorales en ratones. Nosotros S. C., se implantaron cantidades iguales de células de carcinoma de colon Murino que expresaban nnluz o luciferasa de luciérnaga bajo el mismo promotor, se inyectó una mezcla de luciérnagas y luciferinas fúngicas i. p., y se obtuvieron señales casi idénticas de los implantes (Fig. 3C).

finalmente, nuestro objetivo fue probar si la biosíntesis de luciferina se puede lograr en organismos que carecen de biosíntesis de ácido cafeico. Introducción de tres genes adicionales que codifican para Enzimas de biosíntesis de ácido cafeico a partir de tirosina, Rhodobacter capsulatus tirosina amoníaco liasa y dos E., los componentes de la coli 4-hidroxifenilacetato 3-monooxigenasa (26), en el genoma de la cepa de P. pastoris portadora de genes npga, hisps, h3h y luz dieron lugar a una cepa que era bioluminiscente autónoma cuando se cultivaba en un medio de levadura estándar (Apéndice SI, Figs. S12 y S16).

Por lo tanto, bajo todas las condiciones probadas, la luciferasa Nambi de tipo silvestre es funcional en sistemas heterólogos, posicionándose como un gen reportero prometedor, y la luciferina fúngica se puede sintetizar a partir de aminoácidos aromáticos en otros eucariotas., Además, la luciferina fúngica es un compuesto soluble en agua y permeable a las células, y su reacción de emisión de luz no depende de la disponibilidad de ATP, lo que hace que el sistema bioluminiscente fúngico sea atractivo para numerosas aplicaciones en imágenes biomédicas. Además, se pueden usar varios análogos de luciferina para mejorar la emisión de luz y ajustar sus Espectros, mejorando la penetración de la luz en aplicaciones de imágenes de tejidos profundos (22).

En conclusión, presentamos la cascada enzimática que conduce a la emisión de luz en hongos, que es un sistema de bioluminiscencia eucariota con biosíntesis conocida de luciferina., Hemos demostrado que la luciferina es sintetizada a partir de su precursor hispidina por N. Nambi H3H y que la hispidina puede ser sintetizada directamente por la hispidina sintasa a partir del ácido cafeico, un metabolito celular generalizado con biosíntesis eficiente que se logró en varios organismos, incluidas cepas de levadura industrialmente relevantes (26)., A solo dos pasos enzimáticos de las principales vías metabólicas, el sistema fúngico tiene un alto potencial para que la biología sintética cree animales y plantas que brillan autónomamente: los intentos de desarrollar tales organismos se han visto limitados hasta ahora por el bajo rendimiento en eucariotas del sistema bioluminiscente bacteriano, el único sistema para el que se conocía la biosíntesis de luciferina (27, 28).

la reconstitución de la vía bioluminiscente fúngica en organismos eucariotas podría permitir aplicaciones donde los tejidos u organismos reportan cambios en su estado fisiológico con emisión de luz autónoma., También podría impulsar el desarrollo de la próxima generación de arquitectura orgánica (29), donde las plantas brillantes genéticamente modificadas se integrarán en los edificios y la infraestructura de la ciudad. Aparte de eso, con su intrigante historia evolutiva, una familia de luciferasas y su simplicidad general, el sistema bioluminiscente fúngico presentado aquí es un patio de recreo molecular que alberga numerosas oportunidades para la investigación básica y aplicada.,