1 Introducción
Las proteínas integrales de membrana constituyen una gran proporción de los genomas de muchos organismos—aproximadamente el 25% del genoma humano—y realizan una amplia gama de funciones, incluidos los pasos clave en la comunicación de una célula con su entorno., Debido a su importancia biológica y terapéutica (Almén, Nordström, Fredriksson, & Schiöth, 2009), las proteínas de membrana son el foco de Investigación Biofísica fundamental y aplicada para caracterizar estructuras tridimensionales, dinámicas e interacciones en entornos similares a los nativos.,
la espectroscopia de RMN de Estado de solución ha desempeñado un papel crítico en los estudios biofísicos de proteínas de membrana, ya que la información dinámica e interacción específica del sitio proporcionada por dichos enfoques complementa muy bien los datos estructurales obtenidos de la difracción de rayos X, cryo-EM y análisis computacionales (Cuniasse, Tavares, Orlova, & Zinn-Justin, 2017; Opella & Marassi, 2017)., Fundamental para tales estudios son varios 2D «espectros de huellas dactilares», más a menudo 15N/1h hsqc (heteronuclear coherencia cuántica única) espectros (para amida troncal más TRP, Asn, y Gln sidechains) o metil 13C / 1h HMQC (heteronuclear multiple-Quantum coherence) espectros para grupos metilo sidechain (Pellecchia et al., 2008). Estos experimentos metilo-dirigidos son especialmente ventajosos para los complejos grandes, lentos de la proteína/del lípido de la membrana; los experimentos dirigidos a otros sitios de la cadena lateral y de la cadena principal se han aplicado con éxito también., Los experimentos de RMN pueden proporcionar información sobre la dinámica de proteínas en muchas escalas de tiempo, desde movimientos de cadena lateral rápidos (ps–ns) hasta cambios conformacionales lentos (µs–ms) (Kasinath, Sharp, & Wand, 2013; Liang & Tamm, 2016; Palmer, 2012; Wand, Moorman, & Harpole, 2013)., Muchos de estos experimentos dinámicos, a menudo utilizando grupos metilo de cadena lateral como sondas, se han adaptado y desarrollado para grandes sistemas biomoleculares y se pueden usar para proteínas de membrana (Rosenzweig & Kay, 2014; Sun, Kay, & Tugarinov, 2011; Tugarinov, Hwang, Ollerenshaw, & Kay, 2003).
una ventaja particular de la RMN en estado de solución es que las proteínas se estudian en un estado de solución similar al nativo donde pueden interconvertirse entre múltiples conformaciones., Sin embargo, las proteínas de membrana deben solubilizarse en una membrana mimética adecuada que mantenga la estructura y dinámica nativas. Las diferentes opciones incluyen micelas detergentes, anfipoles, bicelles, nanodiscs, SMALPs y vesículas lipídicas, cada una con sus propios beneficios e inconvenientes (Liang & Tamm, 2016, 2018; Zhou & Cross, 2013). A menudo es necesario probar diferentes estrategias de solubilización para una muestra de proteína dada para la estabilidad, la intensidad y la resolución de la señal, y la estructura/actividad nativa., Dos consideraciones importantes para todos los miméticos de membrana son (1) Un tamaño de partícula uniforme y pequeño y (2) un alto grado de deuteración.
la deuteración de alto nivel, tanto dentro de la membrana mimética como de la propia proteína, es fundamental para reducir el número de señales de 1H presentes en los espectros (incluidas las de los lípidos, que pueden ser intensas) y para mejorar las características de relajación de los espines activos de RMN restantes en la muestra., Mientras que la deuteración es posible para la membrana mimética a través de la compra/síntesis de compuestos deuterados, reemplazar 1H con 2h en proteínas requiere incorporación biosintética. Para experimentos troncales en sistemas de expresión eucariótica, uno puede etiquetar uniformemente con 15N para observar todas las amidas(Eddy et al., 2018; Opitz, Isogai, & Grzesiek, 2015) o mediante la adición de aminoácidos específicamente Etiquetados (Isogai et al., 2016)., Para los grupos metilo, uno puede proporcionar aminoácidos debidamente etiquetados o precursores de aminoácidos (particularmente Alfa-ceto ácidos) a los medios de crecimiento para acceder a varios patrones de etiquetado en las cadenas laterales de varios aminoácidos (Kofuku et al., 2014, 2018).,ind isoleucina δ1 grupos metilo particularmente útil dada (1) la abundancia de residuos Ile en proteínas integrales de membrana incluyendo GPCRs (Ulmschneider & Sansom, 2001), (2) el cambio de campo 13C lejano de isoleucina δ1 grupos metilo , poniéndolos en una región particularmente poco concurrida de espectros 2D 13C/1h, (3) la falta de necesidad de asignar grupos metilo, a diferencia de Val y leu, y (4) la presencia de múltiples enlaces libremente girables entre el grupo metilo y la columna vertebral de la proteína, proporcionando una independencia sustancial de la dinámica en estos sitios (kasinath et al.,, 2013).
mientras que muchas de las estrategias de etiquetado antes mencionadas han sido bien desarrolladas para E. coli, muchas proteínas integrales de membrana solo pueden expresarse en niveles altos en huéspedes eucariotas. Entre estos, la levadura metilotrófica Pichia pastoris es un huésped conveniente para la expresión heteróloga y el etiquetado isotópico de proteínas de membrana eucariótica (Clark, Dikiy, Rosenbaum, & Gardner, 2018)., Las ventajas de Pichia incluyen la rapidez de la manipulación genética, los altos rendimientos de proteína recombinante, la existencia de modificación postraduccional (PTM) y la maquinaria de chaperona necesaria para las proteínas de membrana eucariótica, y la capacidad de crecer en medios mínimos definidos que permiten la perdeuteración (Cereghino & Cregg, 2000; Morgan, Kragt, & Feeney, 2000). El etiquetado isotópico uniforme en Pichia ha sido bien establecido (Morgan et al., 2000; Pickford & O’Leary, 2004)., Hemos ampliado este trabajo demostrando el etiquetado 13C, 1h de los grupos δ1-metilo de isoleucina en un fondo perdeuterado agregando α-cetobutirato etiquetado (etiquetado~ 50%, deuteración ~ 90%) a medios de crecimiento altamente deuterados (Clark et al., 2017, 2015). En contraste, el etiquetado simultáneo de los grupos δ – y γ-metilo de leucina y valina Con α-ketoisovalerato es ineficiente, pero se puede lograr agregando valina etiquetada directamente a los medios de crecimiento o modificando las condiciones de cultivo (Clark et al., 2015; Suzuki et al., 2018; Zhang et al., 2017)., Pichia puede tomar fácilmente aminoácidos adicionales de los medios, con una correlación general entre la eficiencia de absorción y el costo energético para sintetizar ese tipo de aminoácido de novo (Heyland, Fu, Blank, & Schmid, 2011). Sin embargo, después de la absorción en las células, los aminoácidos marcados pueden ser introducidos en las vías metabólicas (Solà, Maaheimo, Ylonen, Ferrer, & Szyperski, 2004), diluyendo la señal de los aminoácidos deseados y complicando el análisis de datos mediante la codificación isotópica., Alternativamente, se pueden desarrollar cepas auxotróficas para etiquetar un aminoácido específico; sin embargo, se debe tener cuidado para confirmar que no surjan efectos fuera del objetivo en otras vías metabólicas (Whittaker, 2007).
Aquí proporcionamos protocolos detallados necesarios para generar tales proteínas integrales de membrana etiquetadas con u-2h (13C, 1h-Ile δ1 metil) por sobreexpresión en Pichia, utilizando el receptor humano de adenosina A2A como sistema modelo., Detallamos más cómo estas muestras se pueden usar en estudios de RMN en solución, desde la adquisición de espectros HMQC simples de 13C/1h, pasando por asignaciones de cambios químicos por mutagénesis dirigida al sitio, hasta análisis de mediciones de relajación cruzada de 1h-1h de Dinámica de cadena lateral rápida.