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Clostridium difficile es un patógeno nosocomial anaeróbico formador de esporas asociado con diarrea o colitis leve a mortal (1, 2). La colonización por C. difficile aumenta con la duración de la estancia hospitalaria después de la exposición ambiental a esporas o el contacto con una persona infectada (3). Se ha notificado contaminación y supervivencia de esporas de C. difficile en superficies inanimadas del hospital (4, 5) y se ha demostrado que están asociadas con transmisión cruzada (6,-8).,

la inactivación y erradicación de las esporas de Clostridium difficile son un desafío, y se han investigado varias técnicas relativamente nuevas, como el vapor de peróxido de hidrógeno, la radiación UV o los sistemas de plasma gaseoso(5, 6, 9, 10). La validación de tales técnicas debe utilizar métodos óptimos de recuperación para cuantificar mejor la eliminación o erradicación de esporas bacterianas.

se han utilizado diversos métodos para detectar C. difficile en el entorno hospitalario con resultados variables (11, 12). Aquí presentamos una evaluación de diferentes métodos para detectar y recuperar C., esporas difficile de materiales que se encuentran comúnmente en el entorno hospitalario.

(los datos preliminares de este estudio se presentaron como póster en el Congreso Europeo de Microbiología Clínica y Enfermedades Infecciosas, Barcelona, España, mayo de 2014.)

se incluyó en el estudio una cepa de referencia de C. difficile, ATCC 700057 (Cruinn Diagnostics, Irlanda) y un aislado clínico no caracterizado (Diagnostic Laboratory, Beaumont Hospital, Dublín, Irlanda). Una modificación del Protocolo de preparación de esporas de C. difficile descrita por Chilton et al. se utilizó (13). Brevemente, C., difficile fue inoculado en infusión cerebral pre-inducida suplementada con extracto de levadura y L-cisteína, incubada anaeróbicamente a 37°C durante 48 h, y esparcida sobre 10 placas de Agar sanguíneo Columbia (Oxoid, Reino Unido), las cuales fueron incubadas anaeróbicamente a 37°C durante 10 días (14). El crecimiento se recolectó de las placas utilizando un raspador celular y se suspendió en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS)-etanol (50% ). Las suspensiones se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h con mezcla periódica., Las suspensiones de esporas se centrifugaron durante 10 min a 16.000 × g , y los pellets se resuspendieron en 1 ml de PBS. El número y la pureza de las esporas se determinaron mediante microscopía utilizando el kit de tinción de esporas de Schaeffer y Fulton (Sigma-Aldrich, Irlanda). Las suspensiones se ajustaron a una concentración de aproximadamente 105 UFC / ml (una colonia equivale a una espora), y se prepararon diluciones seriadas 1:10 en PBS.

C., las suspensiones de esporas difficile (50 µl), que van desde 105 hasta 10 UFC/ml, se añadieron por duplicado a secciones de 25 cm2 de tejido de colchón de poliuretano (Meditec Medical, Irlanda), polipropileno (GoodFellow Cambridge, Ltd., Reino Unido) y acero inoxidable, todos descontaminados como se ha descrito anteriormente (15). Las suspensiones de esporas aplicadas a las superficies se secaron al aire durante 2 h. las superficies se muestrearon utilizando hisopos de rayón premoistenados y hisopos de nylon flocados (Copán, Italia) y se colocaron en 3 ml de PBS. Las diluciones seriadas de las suspensiones del hisopo se inocularon sobre placas selectivas de C. difficile-C., difficile agar base CM0601 plus C. difficile suplemento SR0096 (250 mg/litro D-cicloserina, 8 mg / litro cefoxitin) y 7% (vol/vol) defibrinated horse blood (SR0050) – proporcionado por Oxoid para la enumeración de CFU/ml. Las placas de contacto estériles (VWR) se vertieron en el laboratorio con agar selectivo de C. difficile y se aplicaron a cada sección durante 20 s, asegurando un contacto firme con la superficie. Las placas subculturadas de ambos hisopos y placas de contacto se incubaron durante la noche anaeróbicamente a 37 ° C. el recuento de colonias se realizó al día siguiente., El límite de detección (LOD) se definió como la menor concentración de esporas aplicadas que se detectó mediante un método específico. Todos los métodos se evaluaron de forma independiente, apuntando a toda la sección, y se compararon sus capacidades para detectar y recuperar las esporas de C. difficile. El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism 5.00. Los promedios de tres experimentos independientes del porcentaje de recuperación para los diferentes métodos fueron analizados por análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y la prueba de comparación múltiple de Tukey.,

en 1983, uno de los primeros informes comparando métodos para la recuperación de esporas de C. difficile de una superficie de vidrio ambiental mostró que, de hisopos, paletas adhesivas y placas de contacto, las placas de contacto eran, con mucho, el método más eficiente, detectando esporas a niveles bajos, siendo más simple de usar y relativamente rápido (16). Desde entonces, varios métodos, incluyendo hisopos, placas de contacto, guantes y esponjas, se han utilizado para la investigación y la investigación de brotes con resultados variables. Aquí, demostramos que las placas de contacto lograron la mayor recuperación de C., esporas difficile (14% a 92%) de varias superficies, incluyendo el material del colchón, polipropileno y acero inoxidable, confirmando y extendiendo los resultados de Buggy et al. (16) para la recuperación del vidrio. La recuperación también fue eficiente para los hisopos flocados (14% a 76%), y el método menos eficiente fue el hisopozo de rayón (7% a 58%) (Fig. 1A y b).B). El porcentaje de recuperación fue directamente proporcional al tamaño del inóculo inicial, es decir, un inóculo de 105 UFC/ml permitió que las placas de contacto se recuperaran tanto como el 92% y tan solo el 14% para un inóculo de 10 UFC/ml., Las placas de contacto también fueron más sensibles a la detección de esporas con un inóculo mínimo de 10 UFC/ml, mientras que el LD fue de 102 UFC/ml para hisopos flocados y de 103 UFC/ml para hisopos de rayón, pero esto solo fue cierto para el aislado clínico. Estadísticamente, las placas de contacto fueron mejores que los hisopos flocados en polipropileno para el aislado clínico (p < 0,05) (Tabla 1) y persistentemente superiores a los hisopos de rayón (p < 0,05 a p < 0,001) (Tabla 1), mientras que no hubo diferencia significativa entre los hisopos flocados y los de rayón., Aunque el análisis estadístico no reveló ninguna diferencia significativa en las recuperaciones entre todas las superficies estudiadas, las recuperaciones del material del colchón se redujeron ligeramente en comparación con las de las otras dos superficies. Además, no se observaron diferencias estadísticas entre los dos aislados.