… basado en BACTOSCAN FC, que utiliza bromuro de etidio para teñir bacterias en la leche, proporciona un resultado después de 8 min (5, 30). También se ha descrito previamente una técnica citométrica de flujo para la medición de TBC en leche cruda y a temperatura ultraalta con la tinción SYTO BC (16). Sin embargo, estas técnicas son muy específicas, detectando una sola especie, o inespecíficas, detectando todas las bacterias., Todavía no se han descrito las técnicas citométricas de flujo para la diferenciación de bacterias en la leche en grupos más grandes, como bacterias gram-positivas y gram-negativas. La tinción de Gram fue descrita inicialmente en 1883 por el colega de Christian Gram, Carl Friedlander, dividiendo las bacterias en dos grupos, y de nuevo en 1884 por Christian Gram (12, 14). El procedimiento convencional de tinción de Gram incluye las manchas crystal violet y safranin. Las células fijadas por calor en un portaobjetos se tiñen de azul-violeta con violeta cristalino, y luego se tratan con etanol., Las bacterias Gram-negativas son decoloradas por etanol, mientras que las bacterias gram-positivas permanecen manchadas con violeta cristalino. De aquí en adelante, la safranina se utiliza para contrarrestar las bacterias gram – negativas, dando a este grupo un aspecto rosado. Se han reportado numerosos enfoques alternativos para identificar la reacción de Gram. Un método en el que una colonia de bacterias se somete a hidróxido de potasio al 3% es ampliamente utilizado. La alta concentración de hidróxido de potasio Lisan bacterias gramnegativas, liberando ADN de las células, lo que se puede confirmar tirando de una cuerda viscosa de la Colonia (15, 26)., Se ha descrito una técnica alternativa de tinción por Gram con una lectina conjugada con fluoresceína aglutinina de germen de trigo (WGA) para la epifluorescencia combinada y un microscopio de contraste de fase (29). WGA se une a la N-acetilglucosamina en la capa de peptidoglicano de la pared celular. Las bacterias Gram-negativas tienen una capa de lipopolisacárido que cubre la pared celular y es por eso que no se tiñen con WGA, mientras que las bacterias gram-positivas se tiñen con WGA, ya que no tienen una capa de lipopolisacárido., Estos resultados mostraron una insensibilidad a la edad del cultivo lo que implicó que esta tinción podría ser utilizada directamente en muestras sin precultivo de la muestra. Se ha descrito una versión Modi fi ed de la técnica WGA para bacterias que se encuentran en un ambiente no alimentario en el que las bacterias se inmovilizan en un fi lter, se lavan y luego se tiñen con WGA (11). También se han propuesto algunas técnicas de tinción por Gram para citometría de flujo. Se utiliza la tinción lipofílica fluorescente rho-damine 123, que tiñe selectivamente bacterias gram-positivas., La capa de lipopolisacáridos de bacterias gramnegativas pre-ventila la entrada de rodamina 123 (1, 28). Otra técnica similar combina las dos tinciones fl uorescentes de unión al ADN, SYTO 13 y yoduro de hexidio (HI). SYTO 13 es una mancha permeable a la membrana, y HI es bloqueada por la capa de lipopolisacáridos de bacterias gram-negativas y por lo tanto solo permeable a bacterias gram-positivas y bacterias gram-negativas con una capa de lipopolisacáridos estabilizada (22). Sin embargo, debido a la naturaleza frágil de la capa de lipopolisacáridos, no se cree que estas técnicas sean adecuadas para muestras no cultivadas., El objetivo del presente trabajo ha sido desarrollar una técnica de tinción Gram basada en la tinción de bacterias con WGA E HI y seguida de detección citométrica flow. La técnica se evaluó en bacterias asociadas a la leche (19, 20) en fase estacional y después de 6, 12 y 48 h de incubación en medios Labo – ratorios. Además, el método se probó en cultivos en fase de estación que se habían almacenado durante 24 h a Ϫ 18 ° C y durante 14 días a 5 ° C. finalmente, la técnica se aplicó a leche de tanque a granel enriquecida con bacterias conocidas., Una técnica para la diferenciación de bacterias gram-positivas y gram-negativas en leche de tanque a granel sin pre-cultivo será la aplicación final. La figura 1 muestra el efecto de la concentración de KCl en la Unión de WGA a las bacterias gram-positivas M. luteus y S. uberis , cuando las bacterias son teñidas por WGA solo, excluyendo HI. En los histogramas el ruido se ve a la izquierda, donde se han acumulado eventos con bajas intensidades de fl uorescencia (se utilizó un trillo para cortar la mayor parte del ruido)., Cuando las bacterias se tiñen suf cientemente para distinguirlas del ruido, aparecerán como un pico completamente separado del ruido. Usando 0 M KCl, ninguna de las dos bacterias se manchó lo suficiente como para separarlas del ruido. Usando 1 m KCl, se observó un aumento de la intensidad de fl uores – cencia para ambas bacterias. M. luteus fue entonces separado del ruido, y S. uberis solo ligeramente sobrepasó el ruido. El aumento de la concentración de KCl a 3 M mejoró aún más la Unión (mayores intensidades de FL uorescencia) de WGA a estas cepas de bacterias, especialmente para M. luteus ., Las observaciones microscópicas demostraron que las bacterias gram-positivas fueron teñidas por WGA, mientras que las bacte-Ria gram-negativas no fueron teñidas por WGA. HI tiñó tanto las bacterias gram – positivas como las gram-negativas. La figura 2 muestra un ejemplo de la tinción de una mezcla (1:1) del gram-positivo M. luteus y del gram-negativo E. coli con WGA y HI. Como resultado de la tinción, M. luteus apareció con una superficie verde (WGA) y un citoplasma rojo (HI), mientras que E. coli solo apareció con un citoplasma rojo. Gráficos isométricos de análisis citométricos de cultivos de E. coli, M., luteus, y una mezcla (1: 1) de éstos se muestran en la Fig. 3. La medición de E. coli sola (Fig. 3A), el 100% de los eventos estuvieron presentes en la región gram-negativa. Solo para M. luteus (Fig. 3B), el 99% de los eventos fueron en la región gram-positiva y el 1% de los eventos entraron en la región gram-negativa. Cuando se mezclaron cultivos de E. coli y M. luteus (Fig. 3C), el 50% de los eventos se observaron en cada región. Cada una de las 12 cepas bacterianas se midió por duplicado después de 6,12, 24 y 48 h de incubación. De cada medición, se utilizaron 100 eventos para los cálculos. En La Fig., 4 se presenta una parcela ensamblada que incluye los 800 eventos para cada una de las 12 cepas bacterianas analizadas durante 48 h de incubación (un total de 9.600 eventos). Cada cepa bacteriana se presenta con un color distinto. Se muestra una mejor línea calculada para separar bacterias gram-positivas y gram-negativas. En general, la línea aseguró que el 97% de los eventos se interpretaran correctamente. Los porcentajes de células interpretados correctamente para las cepas individuales fueron calculados y se presentan en la tabla 1. Para E. cloacae, E. coli, K. oxytoca, L. lactis, M. luteus, S. aureus, S. agalactiae, S., dys-galactiae , y S. uberis, casi todas las células (Ͼ 96%) fueron interpretadas correctamente para cualquier tiempo de incubación. Para B. cereus, P. fl uores-cens y P. putida , after el 93% de las células fueron interpretadas correctamente después de 12 y 24 h de incubación, mientras que después de 6 y 48 h de incubación solo el 75 a 89% de las células fueron interpretadas correctamente. En la Tabla 2 se presentan los resultados de los análisis citométricos por flujo de las culturas sometidas a diferentes condiciones de almacenamiento., Cuando los cultivos se almacenaron a 5 ° C durante 14 días, la técnica de tinción parecía estar influenciada por la edad del cultivo, especialmente para bacterias gramnegativas. El porcentaje promedio de células correctamente interpretadas fue del 86%. Para E. coli, M. luteus , S. agalactiae , S. dysgalactiae y S. uberis , la mayoría de las células ( Ͼ 97%) fueron interpretadas correctamente. Para B. cereus, E. cloacae, K. oxytoca, L. lactis y S. aureus, 76 a 89% fueron interpretados correctamente , y para P. fl uorescens y P. putida, las fi guras fueron 58 y 68%, respectivamente., La congelación no parecía afectar a la técnica de tinción. Después del almacenamiento a Ϫ 18 ° C durante 24 h, Ͼ el 98% de las células fueron interpretadas correctamente para E. cloacae , E. coli , K. oxy – toca , L. lactis , P. putida , S. aureus , S. agalactiae , S. dysgalactiae y S. uberis . Para B. cereus y p. fl uorescens, las fi guras fueron del 83 y 82%, respectivamente. En la figura 5 se muestran las gráficas isométricas de analisis Flo-citométricas de S. aureus y E. coli agregadas a la leche del tanque a granel. Para S. aureus (Fig. 5A), el 98% de los eventos fueron en la región gram-positiva y el 2% de los eventos entraron en la región gram-negativa., Para E. coli (Fig. 5B), el 96% de los eventos fueron en la región gram – negativa y el 4% de los eventos entraron en la región gram-positiva. La contribución de las bacterias naturales presentes en la leche representó menos del 0,1%. La adición de una alta concentración de KCl a la solución de tinción mejoró la capacidad de WGA para teñir bacterias gram-positivas. Una posible explicación es que las bacterias grampositivas tienen ácidos teicoicos Unidos perpendicularmente a sus paredes celulares, lo que, para algunas bacterias grampositivas, puede bloquear el acceso de WGA a la pared celular., Cuando la concentración de KCl es baja, la estructura de los ácidos teicoicos es rígida, pero al aumentar la concentración de KCl, la estructura se aflojará a medida que los iones de potasio eliminen las cargas negativas en los ácidos teicoicos, causando que la estructura colapse (8, 9). La composición y estructura de los ácidos teicoicos varían entre las especies gram-positivas (24), lo que puede explicar por qué un aumento en la concentración de KCl de 1 a 3 M tuvo un efecto mayor en M. luteus que en S. uberis . En el presente trabajo, se utilizó 3 M de KCl para maximizar la Unión de WGA a bacterias grampositivas., Las técnicas para la eliminación de la organización de los ácidos teicoicos han sido previamente solo reportadas para aplicaciones microscópicas. Estas técnicas incluyen el uso de fi xación de tetróxido de osmio por adición de acetona y evaporación (2) y fi xación de calor de bacterias en un portaobjetos microscópico (29). Sin embargo, estos tratamientos no pudieron ser considerados en el presente estudio, ya que un paso de deshidratación no es adecuado para citometría de flujo., La técnica de tinción por Gram mostró resultados confiables para todas las cepas después de 6, 12, 24 y 48 h de incubación, para lo cual casi todas las células (97%) fueron interpretadas correctamente. Estos resultados se corresponden con los resultados del método de tinción de Gram de WGA re-portado …