1 Indledning
Integreret membran proteiner, der udgør en stor del af genomer for mange organismer—ca 25% af det menneskelige genom—og udføre en bred vifte af funktioner, herunder vigtige trin i kommunikationen i en celle med sine omgivelser., På grund af deres biologiske og terapeutiske betydning (Almén, Nordström, Fredriksson, & Schiöth, 2009), membran proteiner, der er i fokus på grundforskning og anvendt biofysisk forskning til at karakterisere tre-dimensionelle strukturer, dynamik og samspil i native-lignende miljøer.,
Løsning-state NMR-spektroskopi har spillet en afgørende rolle i membran protein biofysiske undersøgelser, som site-specifik dynamisk og interaktion oplysninger, som leveres af disse tilgange pænt supplerer strukturelle data fra røntgen diffraktion, cryo-EM, og beregningsmæssige analyser (Cuniasse, Tavares, Orlova, & Zinn-Justin, 2017; Opella & Marassi, 2017)., Grundlæggende til sådanne undersøgelser er flere 2D – “fingeraftryk spektre,” oftest 15N/1H HSQC (heteronuclear enkelt-kvante-kohærens) spektre (for rygraden amid plus Trp, Asn, og Gln sidechains) eller methyl-13C/1H HMQC (heteronuclear flere quantum sammenhæng) spektre for sidechain methylgrupper (Pellecchia et al., 2008). Disse methyl-instrueret eksperimenter er især en fordel for store, langsomme-tumbling membran protein/lipid komplekser; forsøg rettet mod andre sidechain og mainchain steder har været anvendt med succes samt., NMR-eksperimenter, der kan give information om proteiners dynamik over mange tidsfrister, fra hurtig (ps–ns) sidechain forslag til langsom konformationelle ændringer (µs–ms) (Kasinath, Skarpe, & Wand, 2013; Liang & Tamm, 2016; Palmer, 2012; Tryllestav, Moorman, & Harpole, 2013)., Mange af disse dynamik, eksperimenter, ofte ved hjælp af sidechain methyl-grupper, som sonder, er blevet tilpasset og udviklet til store biomolekylær systemer, og kan anvendes til membranproteiner (Rosenzweig & Kay, 2014; Sol, Kay, & Tugarinov, 2011; Tugarinov, Hwang, Ollerenshaw, & Kay, 2003).
en særlig fordel ved opløsning-tilstand NMR er, at proteiner studeres i en native-lignende opløsning tilstand, hvor de kan interkonvertere blandt flere konformationer., Imidlertid skal membranproteiner opløseliggøres i en passende membranmimetikum, der opretholder den oprindelige struktur og dynamik. Forskellige muligheder omfatter rengøringsmiddel miceller, amphipols, bicelles, nanodiscs, SMALPs, og lipid-vesikler, som hver især har deres egne fordele og ulemper (Liang & Tamm, 2016, 2018; Zhou & Cross, 2013). Det er ofte nødvendigt at teste forskellige opløsningsstrategier for en given proteinprøve for stabilitet, signalintensitet og opløsning og native struktur/aktivitet., To vigtige overvejelser for alle membranmimetika er (1) en ensartet og lille partikelstørrelse og (2) en høj grad af deuteration.
Høj-niveau deuteration, både inden for membranen mimetic og protein i sig selv, er afgørende for at reducere antallet af 1H signaler er til stede i spektre (herunder dem fra lipider, som kan være intens) og at forbedre afslapning karakteristika af de resterende NMR-aktiv spins i prøven., Mens deuteration er mulig for membranmimetikum gennem køb/syntese af deutererede forbindelser, kræver udskiftning af 1H med 2H i proteiner biosyntetisk inkorporering. Til rygradseksperimenter i eukaryote ekspressionssystemer kan man mærke ensartet med 15N for at observere alle amider (Eddy et al., 2018; Opitz, Isogai, & Grzesiek, 2015) eller gennem tilsætning af specifikt mærket aminosyrer (Isogai et al., 2016)., For methylgrupper kan man give enten passende mærkede aminosyrer eller aminosyreprecursorer (især alfa-ketosyrer) til vækstmedier for at få adgang til forskellige mærkningsmønstre i sidekæderne af flere aminosyrer (Kofuku et al., 2014, 2018).,ind isoleucin δ1 methyl-grupper, der er særlig nyttige i betragtning (1) den overflod af Ile rester i integreret membran proteiner, herunder GPCRs (Ulmschneider & Sansom, 2001), (2) den langt op ad banen, 13C skift af isoleucin δ1 methyl-grupper , sætte dem i en særlig uncrowded region 2D-13C/1H spektre, (3) den manglende behov for at stereospecifically tildele disse methyl-grupper, i modsætning til Val og Leu, og (4) tilstedeværelsen af flere, frit drejelig obligationer mellem-methyl-gruppen og protein backbone, hvilket giver en betydelig uafhængighed af dynamikken på disse steder (Kasinath et al.,, 2013).
mens mange af de ovennævnte mærkningsstrategier er veludviklede for E. coli, kan mange integrerede membranproteiner kun udtrykkes i høje niveauer i eukaryote værter. Blandt disse, den methylotrophic gær Pichia pastoris er en praktisk vært for heterolog ekspression og isotop mærkning af eukaryote membranproteiner (Clark, Dikiy, Rosenbaum, & Gardner, 2018)., Fordele ved Pichia omfatter hurtighed af den genetiske manipulation, høje udbytter af rekombinant protein, eksistensen af posttranslational ændring (PTM) og anstandsdame maskiner, der er nødvendige for eukaryote membran proteiner, og evnen til at vokse på er defineret minimal medier, der giver mulighed for perdeuteration (Cereghino & Cregg, 2000; Morgan, Kragt, & Feeney, 2000). Ensartet isotopmærkning i Pichia er veletableret (Morgan et al., 2000; Pickford & O ‘ Leary, 2004)., Vi har udvidet dette arbejde ved at påvise, 13C, 1H mærkning af isoleucin δ1-methyl-grupper i en perdeuterated baggrund ved at tilføje mærket α-ketobutyrate (~ 50% mærkning, ~ 90% deuteration) til meget deuterated vækst medier (Clark et al., 2017, 2015). I modsætning hertil er samtidig mærkning af leucin and-og valin γ-methylgrupper med α-ketoisovalerat ineffektivt, men kan opnås ved at tilføje mærket valin direkte til vækstmediet eller modificere kulturbetingelser (Clark et al., 2015; su .uki et al., 2018; 201hang et al., 2017)., Pichia kan let tage ekstra aminosyrer fra medier, med en generel sammenhæng mellem udbredelse, effektivitet og energiske omkostninger til at syntetisere, at aminosyre-type “de novo” (Heyland, Fu, Tom, & Schmid, 2011). Men efter optagelse i celler, der hedder aminosyrer kan blive ført ind i den metaboliske pathways (Solà, Maaheimo, Ylonen, Ferrer, & Szyperski, 2004), fortynding signal af den ønskede aminosyrer og kompliceret data analyse af isotop-scrambling., Alternativt, auxotrophic stammer kan være udviklet til at beskrive en bestemt aminosyre; men, pleje skal træffes foranstaltninger til at bekræfte, at off-target effekter i andre metaboliske pathways ikke opstår (Whittaker, 2007).
Her leverer vi detaljerede protokoller, der er nødvendige for at generere sådanne u-2H (13C, 1H-Ile methyl1 methyl)-mærkede integrerede membranproteiner ved overekspression i Pichia ved hjælp af den humane adenosin A2A-receptor som et modelsystem., Vi beskriver yderligere, hvordan sådanne prøver kan bruges i opløsning NMR-undersøgelser, fra at erhverve enkle 13C/1H HM .c–spektre, gennem kemiske skiftopgaver ved site-directed mutagenese, til analyser af 1H-1H cross-afslapningsmålinger af hurtig sidechain-dynamik.