Genetisk encodable selvlysende system fra svampe

• bioluminescens
• svampe luciferin biosynthesis
• svampe-luciferase

Bioluminescens er et naturligt fænomen af lys emission som følge af oxidation af et substrat, luciferin, katalyseret af et enzym, luciferase. En række arter er bioluminescerende i naturen (1); For mange af dem er evnen til at udsende lys et definerende træk ved deres biologi (24 -4). Kunstig integration af naturlige bioluminescerende reaktioner i levende systemer er også blevet et rapporteringsværktøj, der i vid udstrækning anvendes i molekylær-og cellebiologi (5, 6)., Imidlertid forbliver naturlige bioluminescerende systemer Dårligt karakteriseret på et biokemisk niveau, hvilket begrænser mere udbredt anvendelse. Kun 9 luciferiner og 7 luciferase-genfamilier er blevet beskrevet (7, 8) af mindst 40 bioluminescerende systemer, der menes at eksistere i naturen (9). Beklageligt er kun en enkelt biokemisk kaskade, der starter fra en udbredt metabolit til et luciferin, blevet beskrevet i sin helhed (10). Den beskrevne vej er bakteriel og har begrænset anvendelse i eukaryoter (11)., Ingen af de eukaryote bioluminescerende systemer er blevet beskrevet i tilstrækkelig detaljer til at blive udtrykt i en anden organisme eller til at skabe kunstige autonomt bioluminescerende organismer. Her beskriver vi funktionen og udviklingen af de vigtigste gener, der er ansvarlige for bioluminescensen af svampen Neonothopanus nambi og viser, at ekspression af svampegener er tilstrækkelig til at konstruere autonomt bioluminescerende eukaryoter.100 svampearter fra ordenen Agaricales udsender lys ved hjælp af den samme biokemiske reaktion (12)., Selv om deres bioluminescens økologiske rolle ikke er fuldt ud forstået, er der tegn på, at det kan bruges af svampe til at tiltrække sporedistribuerende insekter (13). Svampe bioluminescens var kendt for at bruge mindst fire komponenter: molekylær ilt; luciferin, som for nylig blev udpeget som 3-hydroxyhispidin ; og to tidligere undescribed vigtige enzymer, en NAD(P)H-afhængige hydroxylase og en luciferase (15, 16).

for at identificere en .ymer af den svampebioluminescerende vej fokuserede vi først på isolering af luciferase-genet. Ved at udtrykke N., nambi cDNA-bibliotek i Pichia pastoris og sprøjtning af agarplader med syntetisk 3-hydro .yhispidin identificerede og sekventerede vi en selvlysende gærkoloni, der udtrykker luciferase-genet (SI Appendiks, Fig. S1 og S13). N. nambi luciferase, nnlu protein, er et 267-aa-protein (SI-tillæg, Fig. S2) og har ingen beskrevne homologer eller udtalt sekvens lighed med konserverede proteindomæner, der repræsenterer en ny proteinfamilie.

gener, der koder for en .ymer, der syntetiserer sekundære metabolitter, grupperes ofte i svampegenomer (17)., Vi antog, at dette kan være tilfældet for en .ymer i den bioluminescerende kaskade, fordi det antages, at kaskaden er bevaret blandt de bioluminescerende svampe (12). Vi kiggede således efter gener relateret til luciferinbiosyntese i nærheden af luciferase-genet i N. nambi-genomet. I tillæg til N. nambi, vi også sekventeret genomer og transcriptomes af selvlysende svampe Neonothopanus gardneri, Mycena citricolor, og Panellus stipticus og sammenlignet dem med offentligt tilgængelige genom sekvenser af selvlysende og nonbioluminescent svampe (18, 19)., Vi fandt ud af, at luciferasen er medlem af en konserveret genklynge, der inkluderer mindst to andre gener: h3h og hisps (fig. 1 B og C samt datasæt S1-S3).

h3h-gen viste sekvens lighed med 3-hydroxybenzoat 6-monooxygenases, enzymer, der katalyserer oxidation af 3-hydroxybenzoat hjælp af NADH og molekylær ilt. Denne reaktion er identisk med den, der omdanner hispidin til luciferin (fig. 1A), og således er vi antager, at h3h-genet, der koder for hispidin-3-hydroxylase (H3H), det enzym, der svarer til den forventede hydroxylase (15)., Vi klonede genet fra N. nambi og fandt, at P. pastoris-kolonier, der udtrykker både nnlu.og nnh3h, udsender lys, når de sprøjtes med luciferin-forløber hispidin, i modsætning til kontrolkolonier, der udtrykker nnlu. alene (SI-Appendiks, Fig. S14 og S17) – bekræfter, at nnH3H konverterer hispidin til luciferin.

hisps-genet (fig. 1C) koder for et medlem af polyketidsyntase-familien, en .ymer, der producerer sekundære metabolitter i en række organismer over livets træ (20)., Polyketidsyntaser tilsætter typisk malonyldele til den voksende carbonkæde; dermed, α-Pyron-karakteren af hispidin antydede, at dens biosyntese kan udføres af en polyketidsyntase fra caffeic acid ved to cyklusser med tilsætning af malonylenheder efterfulgt af lactonisering (fig. 1A og Si tillæg, Fig. S3). Store modulære polyketidsyntaser kræver posttranslationelle modifikationer for deres aktivitet (21), såsom overførsel af en phosphopantetheinylgruppe til en konserveret serinrest af acylbærerproteindomænet., For at teste, om hisps gen, der kan producere luciferin forløber i en heterolog system, vi har integreret hisps, nnluz, og nnh3h gener sammen med Aspergillus nidulans 4′-phosphopantetheinyl transferase gen npgA i genomet af P. pastoris. Når dyrket i et medium indeholdende koffeinsyre, gær udtrykker alle fire gener udsendte lys set med det blotte øje (fig . 3A), mens der ikke blev observeret nogen signifikant lysproduktion i stammer, der mangler npga-eller hisps-gener (SI Appendiks, Fig. S15 og S17)., Derfor, hisps katalyserer syntesen af hispidin fra kaffesyre, lukker den kæde af reaktioner (den “kaffesyre cyklus”) fra en fælles cellulær metabolit med kendt biosynthesis at en eukaryot luciferin.

i nogle bioluminescerende svampearter rummer den genomiske klynge en eller to yderligere gener (fig. 1C): den ene tilhører cytokrom P450-familien, og den anden tilhører familien af fumarylacetoacetathydrolaser., Sidstnævnte (cph) sandsynligvis koder en caffeylpyruvate hydrolase (Datasæt S4), der er involveret i oxyluciferin genanvendelse, er i overensstemmelse med caffeylpyruvate, svampe oxyluciferin, at blive hydrolyseret til caffeate og pyruvat af en hydrolase til stede i svampe rå-ekstrakter (22).

bevarelse af genklyngen antyder, at bioluminescens i modsætning til andre grupper af bioluminescerende organismer (23) kun udviklede sig i svampe oncen gang, hvor Lu. -, h3h-og hisps-gener opstod gennem gen-duplikationer. Rekonstruerede fylogenetiske træer for Lu genes, H3H, og hisps gener (SI Appendiks, Fig., S4-S6) og artstræet af ordenens Agaricales (Fig . 2) afslør udviklingen af bioluminescens-kaskaden i svampe. Den primære luz enzym af svampe bioluminescens cascade opstået gennem et gen, der er overlapning i bunden af Agaricales efterfulgt af overlapning af h3h og hisps et par millioner år senere. Interessant nok er mange arter i en stor clade, der koder for hisps, ikke-bioluminescerende, og hisps-homologerne i bioluminescerende arter mangler to domæner, ketoreduktase-og dehydratasedomænerne (SI-Appendiks, fig. S6)., Det er sandsynligt, at tabet af disse funktionelle domæner i den fælles forfader, selvlysende arter begunstiget produktion af α-pyroner af slægts-hisps, muligvis giver det sidste skridt for fremkomsten af bioluminescens.

genklyngen fortsatte med at udvikle sig dynamisk efter erhvervelsen af bioluminescens. Mindst seks uafhængige komplette eller delvise gentabshændelser af gener fra den genomiske klynge førte til sekundært tab af bioluminescens (fig. 2). Cph genet blev indsat i klyngen i nonmycenoid clade, muligvis to gange (fig. 1)., Dette mosaikmønster ligner evolutionær historie med fluorescerende proteiner (24), en anden visuelt relevant proteinfamilie med en uklar biologisk rolle, og kan indikere, at selektiv fordel tilvejebragt ved bioluminescens i svampe afhænger af en specifik eller kortvarig økologisk kontekst.

komplekse tilpasninger kan være en kilde til bioteknologisk relevante løsninger., Ud over at afsløre karakteren af grundlæggende fotokemiske processer og protein-evolution, luciferases er blandt de primære typer af reporter gener, der anvendes i forskellige forsknings-rørledninger, metoder til diagnostik og miljømæssige applikationer (5, 6, 25). For at afgøre, om en svampebioluminescerende vej kan give reportergener, karakteriserede vi nnlu.in vitro og testede dets evne til at producere lys i heterologe systemer.

nnlu protein-proteinet består af 267 aminosyrer og har en molekylmasse på omkring 28,5 kDa (si-tillæg, fig. S7)., Selvom dens cellulære lokalisering in vivo forbliver ukendt, har proteinet en forudsagt N-terminal transmembran Heli., der er i overensstemmelse med colokalisering af luciferaseaktivitet med uopløselige cellefraktioner i tidligere undersøgelser (22). Når det udtrykkes i P. pastoris, var nnlu.forbundet med den mikrosomale fraktion (SI-Appendiks, Fig. S8) og udsendte grønt lys med et maksimum ved 520 nm og spektrum identisk med N. nambi mycelium (fig . 3A og Si tillæg, Fig. S9). Rekombinant nnlu.udsender lys optimalt ved omkring pH 8.,0 og moderate temperaturer, der mister sin aktivitet ved temperaturer over 30 C C (SI Appendiks, Fig. S10).

for at teste potentialet af nnlu.som reportergen i heterologe systemer testede vi dets ekspression i Escherichia coli, P. pastoris, tidlige laenopus laevis-embryoner og humane celler., Selvom luciferase akkumuleres for det meste i inklusionslegemer, når de udtrykkes i bakterier (SI Appendiks, Fig. S7) var alle testede celler og organismer, der udtrykte vildtype nnlu., klart bioluminescerende, når 3-hydro .yhispidin blev tilsat til mediet (fig. 3 og Si Appendiks, Fig. S11 og S22). Vi sammenlignede også nnlu.kvalitativt med luciferasen fra firefly Photinus pyralis i en helkropsbilledopsætning af tumor-xenenografter hos mus. Vi s. c., implanterede lige store mængder af murine colon cancer-celler udtrykker enten nnluz eller firefly luciferase under samme promotor, sprøjtes en blanding af firefly og svampe luciferins jeg.p., og fået næsten identiske signaler fra implantater (Fig. 3C).

endelig havde vi til formål at teste, om luciferin biosyntese kan opnås i organismer, der mangler koffeinsyrebiosyntese. Indførelsen af yderligere tre gener, der koder for enzymer af kaffesyre biosynthesis fra tyrosin, Rhodobacter capsulatus tyrosin ammoniak lyase og to E., coli 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase komponenter (26), i genomet af P. pastoris stamme regnskabsmæssige npgA, hisps, h3h og luz gener, der resulterede i en stamme, der var selvstændigt selvlysende, når de dyrkes i en standard gær medium (SI Tillæg, Figner. S12 og S16).

Således under alle testede betingelser, wild-type N. nambi luciferase er funktionelle i heterolog systemer, positionere sig som en lovende reporter gen, og svampeangreb luciferin kan syntetiseres fra aromatiske aminosyrer i andre eukaryoter., Derudover er svampe luciferin en vandopløselig og cellepermeabel forbindelse, og dens lysemitterende reaktion er ikke afhængig af tilgængeligheden af ATP, hvilket gør det svampe bioluminescerende system attraktivt til adskillige anvendelser inden for biomedicinsk billeddannelse. Desuden kan forskellige luciferin-analoger bruges til at forbedre lysemission og indstille dens spektre, hvilket forbedrer lysindtrængning i applikationer til billeddannelse af dybt væv (22).

afslutningsvis præsenterer vi den en .ymatiske kaskade, der fører til lysemission i svampe, som er et eukaryotisk bioluminescenssystem med kendt biosyntese af luciferin., Vi har vist, at luciferin er syntetiseret fra sin forløber hispidin af N. nambi H3H og at hispidin kan være direkte syntetiseret af hispidin syntase fra kaffesyre, at en udbredt cellulære metabolit med effektiv biosyntese, som blev opnået i forskellige organismer, herunder industrielt relevante gær stammer (26)., Blot to enzymatiske trin fra mainstream metaboliske veje, svampe-system har et stort potentiale for syntetisk biologi for at skabe selvstændigt glødende dyr og planter: forsøg på at udvikle sådanne organismer har hidtil været hæmmet af de dårlige resultater i eukaryoter af de bakterier, selvlysende system, det eneste system, som luciferin biosynthesis var kendt (27, 28).

rekonstitution af svampebioluminescerende vej i eukaryote organismer kan muliggøre applikationer, hvor væv eller organismer rapporterer ændringer i deres fysiologiske tilstand med autonom lysemission., Det kan også fremme udviklingen af den næste generation af organisk arkitektur (29), hvor genetisk modificerede glødende planter vil blive integreret i bygninger og byinfrastruktur. Bortset fra det, med sin spændende evolutionære historie, en familie af luciferaser og generel enkelhed, er det svampebioluminescerende system, der præsenteres her, en molekylær legeplads, der indeholder adskillige muligheder for grundlæggende og anvendt forskning.,