kul-strippet føtal calf serum (se også Ref. 3)
1
tilsæt 250 mg trækul og 25 mg de .tran T-70 til 100 ml føtal kalveserum (FCS).
2
inkuberes ved 56.C i 30 min.
3
centrifugeres ved 3000-4000 o / min i 30 minutter ved stuetemperatur.
4
Overfør supernatanten til friske spande.
5
gentag tidligere trin.
6
Filtrer supernatanten gennem et forfilter (type ap; Millipore, Bedford, MA) for at fjerne trækul.
7
Filtrer opløsningen gennem en 0.,45-μm porestørrelsesfilter (Flo .pore, 64-002-04; ICN Biomedicals, Ltd.).
8
Store portioner ved -20°C.
Gelatine (10 × Lager haves)
1
lav en 1% (w/v) løsning af gelatine (G-2500; Sigma, St. Louis, MO)
2
Autoklaven for 20 min.
3
opbevares ved 4 C. C.
Gelatinebelagte retter/flasker
1
fortynd gelatinebestanden 10 gange.
2
Pipette denne opløsning på opvasken for at dække overfladen af skålen helt (1,5 til 2 ml pr 6 cm skål).
3
lad opvasken stå i 2 timer ved stuetemperatur. For at fremskynde denne procedure kan de placeres i inkubatoren ved 37.C i 1 time.,
4
Aspir ther opvasken.
5
Pak opvasken i aluminiumsfolie og opbevar dem ved stuetemperatur eller ved 4 C. C.
HEBS buffer (10 stock lager)
1 2
tilsæt dobbeltdestilleret vand til 975 ml.
3
Indstil pH-værdien til 7,05 og volumen til 1000 ml.
4
autoklav opløsningen, og opbevar den ved 4 C. C.
5
før brug tilsættes filtreret glucoseopløsning til bufferen (se fremstilling af 2.HEBS).
HEBS (2×)
1
Fortyndes HEBS 10× lager fem gange med sterilt H2O.
2
Tilføj 0,2 ml af en filtreret glucose opløsning (1 g/ml) per 100 ml (endelig koncentration på 10 mM).,3
juster pH–værdien til 7.05-7.08. Dette trin er afgørende for dannelsen af Ca–DNA-komplekset.
4
steriliser opløsningen ved filtrering.
phosphatbufferet saltopløsning (PBS) uden calcium og magnesium (14200-067 M; GIBCO, Grand Island, NY)
CaCl2 (2,5 M)
Medier
Normal medium: Tilberedt med ikke-varme-inaktiverede FCS og mellemstore med phenol red
Steroid-forarmet medium: Udarbejdet med kul-frataget FCS og mellemstore uden phenol red. Dette medium bruges kun, når effekten af hormoner, der normalt findes i serum, skal testes.,
Mængden af plasmid, der anvendes pr transfektion
Reporter plasmid konstruere, 6.5 µg
Udtrykket vektor, 1.0 µg
Udtryk plasmid som en kontrol for transfektion effektivitet, 0.5 µg
Når den totale mængde af DNA, der er mindre end 8 til 10 µg, bærer-DNA (plasmid eller sild sperm DNA) der bør tilføjes for at opnå en god Ca–DNA bundfald
Lysis buffer