… baseret BactoScan FC, der bruger ethidiumbromid til at plette bakterier i mælk, giver et resultat efter 8 min (5, 30). En flow – cytometri-teknik til måling af SK i rå og ultra – temperatur mælk med pletten SYTO BC er også blevet beskrevet tidligere (16). Imidlertid er disse teknikker enten meget specifikke, detekterer kun en art eller ikke-specifik, detekterer alle bakterier., Flo .cytometriske teknikker til differentiering af bakterier i mælk til større grupper som gram-positive og gram-negative bakterier er endnu ikke beskrevet. Gramfarvning blev oprindeligt beskrevet i 1883 af Christian Grams kollega Carl Friedlander, der delte bakterier i to grupper, og igen i 1884 af Christian Gram (12, 14). Den konventionelle Gram-farvning procedure omfatter pletter krystal violet og safranin. Varmefaste celler på et dias er farvet blåviolet med krystalviolet, og efterfølgende behandles de med ethanol., Gram-negative bakterier affarves af ethanol, mens gram-positive bakterier forbliver farvede med krystalviolet. Herefter bruges safranin til at modvirke gram-negative bakterier, hvilket giver denne gruppe et lyserødt udseende. Talrige alternative tilgange til at identificere Gram-reaktionen er blevet rapporteret. En metode, hvor en koloni af bakterier udsættes for 3% kaliumhydro .id, anvendes i vid udstrækning. Den høje koncentration af kaliumhydro .id lyser gram-negative bakterier og frigiver DNA fra cellerne, hvilket kan bekræftes ved at trække en viskøs streng fra kolonien (15, 26)., En alternativ Gram-farvningsteknik med en fluorescein – konjugeret lectin hvedekim agglutinin (gaga) til kombineret epifluorescens og et fase-kontrastmikroskop er blevet beskrevet (29). WGA binder til N-acetylglucosamin i pep – tidoglycan-laget af cellevæggen. Gram-negative bakterier har et lag lipopolysaccharid, der dækker cellevæggen, og det er derfor, de ikke farves med WGA, mens gram-positive bakterier farves med .ga, da de ikke har et lipopolysaccharidlag., Disse resultater viste en ufølsomhed over for kulturens alder, hvilket indebar, at denne plet kunne anvendes direkte på prøver uden forudgående dyrkning af prøven. En modi fi ed-version af techniquega-teknikken er blevet beskrevet for bakterier, der findes i et nonfood-miljø, hvor bakterierne immobiliseres på en fi lter, vaskes og derefter farves med .ga (11). Nogle Gram-farvning teknikker til FL o CYT cytometri er også blevet foreslået. Man bruger den fl uorescerende lipofile plet rho-damine 123, som selektivt pletter gram-positive bakterier., Lipopolysaccharidlaget af gram-negative bakterier udlufter indgangen af rhodamin 123 (1, 28). En anden lignende teknik kombinerer de to fl uorescerende DNA-bindende pletter, SYTO 13 Og HE .idiumiodid (HI). SYTO 13 er en membran er gennemtrængelig pletten, og HI er blokeret af lipopolysaccharide lag af gram-negative bakterier, og dermed kun er gennemtrængelig for gram-positive bakterier og gram-negative bakterier med en de – stabiliseret lipopolysaccharide lag (22). På grund af lipopolysaccharidlagets skrøbelige karakter antages disse teknikker imidlertid ikke at være egnede til udyrkede prøver., Formålet med det nuværende arbejde har været at udvikle en Gram-farvningsteknik baseret på farvning af bakterier med Higa og HI og efterfulgt af fl o.cytometrisk detektion. Teknikken blev evalueret på mælkeassocierede bakterier (19, 20) i den sta – tionære fase og efter 6, 12 og 48 timer af inkubation i labo – ratoriske medier. Endvidere blev metoden testet på Station-ary-fasekulturer, som var blevet opbevaret i 24 timer ved 18 18 C C og i 14 dage ved 5.C. endelig blev teknikken anvendt på bulktankmælk spiket med kendte bakterier., En teknik til differentiering af gram-positive og gram-negative bakterier i bulktankmælk uden prækultivering vil være den ultimative anvendelse. Figur 1 viser virkningen af KCL-koncentrationen på bindingen af .ga til de gram-positive bakterier M. luteus og S. uberis , når bakterierne farves af alonega alene, undtagen HI. I histogrammerne ses støjen til venstre, hvor begivenheder med lave intensiteter for FL uorescens er ophobet (en Tærskeplads blev brugt til at skære det meste af støjen væk)., Når bakterier farves tilstrækkeligt for at skelne dem fra støj, vil de fremstå som en top, der er helt adskilt fra støj. Ved hjælp af 0 M KCl blev ingen af de to bakterier farvet nok til at adskille dem fra støj. Ved anvendelse af 1 M KCl blev der observeret en øget fl uores – cence intensitet for begge bakterier. M. luteus blev derefter adskilt fra støjen, og S. uberis overlappede kun støjen lidt. Forøgelse af KCL-koncentrationen til 3 M forbedrede yderligere bindingen (højere FL uorescensintensiteter) af WGA til disse bakteriestammer, især for M. luteus ., Mikroskopiske observationer viste, at gram-positive bakterier blev farvet af WGA, hvorimod gram-negative bacte – ria ikke blev farvet af .ga. Hej farvede både de gram-positive og de gram-negative bakterier. Figur 2 viser et eksempel på farvning af en blanding (1:1) af den gram-positive M. luteus og gram-negative E. coli med både WGA og HEJ. Som et resultat af farvningen optrådte M. luteus med en grøn overflade (gaga) og en rød cytoplasma (HI), mens E. coli kun optrådte med en rød cytoplasma. Isometriske plots af FL o ow cyto-metriske analyser af kulturer af E. coli, M., luteus, og en blanding (1: 1) af disse er vist i Fig. 3. Måling af E. coli alene (Fig. 3A) var 100% af begivenhederne til stede i den gram-negative region. For M. luteus alene (Fig. 3B) var 99% af begivenhederne i den gram-positive region, og 1% af begivenhederne kom ind i den gram-negative region. Når kulturer af E. coli og M. luteus blev blandet (Fig . 3C) blev 50% af begivenhederne observeret i hver region. Hver af de 12 bakteriestammer blev målt i to eksemplarer efter 6,12, 24 og 48 timers inkubation. Fra hver måling blev 100 hændelser brugt til beregninger. I Fig., 4 en samlet plot præsenteres som omfatter alle 800 hændelser for hver af de 12 bakteriestammer testet under 48 timer af inkubation (i alt 9.600 hændelser). Hver bakteriestamme er præsenteret med en tydelig farve. En beregnet bedste linje til adskillelse af gram-positive og gram-negative bakterier er vist. Samlet set sikrede linjen, at 97% af begivenhederne blev fortolket korrekt. De procenter af celler, der er korrekt fortolket for de enkelte stammer, blev kalkuleret og er præsenteret i tabel 1. For E. cloacae , E. coli , K. oxytoca , L. lactis , M. luteus , S. aureus , S. agalactiae , S., dys-galactiae og S. uberis blev næsten alle celler ( 96 96%) korrekt fortolket for enhver inkubationstid. For B. cereus , P. fl uores – cens og P. putida blev 93 93% af cellerne fortolket korrekt efter 12 og 24 timers inkubation, hvorimod efter 6 og 48 timers inkubation blev kun 75 til 89% af cellerne fortolket korrekt. I tabel 2 præsenteres resultaterne fra de cytometriske analyser af kulturer, der er underkastet forskellige opbevaringsbetingelser., Da kulturerne blev opbevaret ved 5 C C i 14 dage, syntes farvningsteknikken at være i overensstemmelse med kulturens alder, især for gramnegative bakterier. Den gennemsnitlige procentdel af korrekt fortolkede celler var 86%. For E. coli, M. luteus, S. agalactiae, S. dysgalactiae og S. uberis blev de fleste celler ( 97 97%) korrekt fortolket. For B. cereus , E. cloacae , K. oxytoca , L. lactis , og S. aureus , 76 til 89% var korrekt fortolket, og for P. fl uorescens og P. putida , fi gurer var 58 og 68%, henholdsvis., Frysning syntes ikke at være i fl uence farvningsteknikken. Efter opbevaring på Ϫ 18 ° C i 24 h, Ͼ 98% af cellerne blev fortolket korrekt for E. cloacae , E. coli , K. oxy – toca , L. lactis , P. putida , S. aureus , S. agalactiae , S. dysgalactiae , og S. uberis . For B. cereus og P. FL uorescens var tallene henholdsvis 83% og 82%. Figur 5 viser de isometriske plot af fl o. – cytometriske anal-Yser af S. aureus og E. coli tilsat til bulktank mælk. For S. aureus (Fig. 5A) var 98% af begivenhederne i den gram-positive region, og 2% af begivenhederne kom ind i den gram-negative region., For E. coli (Fig . 5B) var 96% af begivenhederne i den gram – negative region, og 4% af begivenhederne kom ind i den gram-positive region. Bidraget fra de naturlige bakterier, der er til stede i mælken, tegnede sig for mindre end 0,1%. Tilsætningen af en høj koncentration af KCl til farvningsopløsningen forbedrede abilityga ‘ s evne til at plette gram-positive bakterier. En mulig forklaring er, at gram-positive bakterier har teichoesyrer bundet vinkelret på deres cellevægge, som for nogle gram-positive bakterier kan blokere WGA ‘ s adgang til cellevæggen., Når koncentrationen af KCl er lav, er den struktur af teichoic syrer er stive, men ved at øge koncentrationen af KCl, vil strukturen løsnes som kalium-ioner fjerne de negative ladninger på teichoic syrer, hvilket får strukturen til at kollapse (8, 9). Sammensætning og struktur af teichoic fedtsyrer varierer mellem gram-positive arter (24), hvilket kan forklare, hvorfor en stigning i KCl koncentration fra 1 til 3 M havde en større effekt på M. luteus end på S. uberis . I det nuværende arbejde blev 3 M KCl brugt til at maksimere bindingen af WGA til gram-positive bakterier., Teknikker til eliminering af organiseringen af teichoesyrerne er tidligere kun blevet rapporteret til mikroskopiske anvendelser. Disse teknikker omfatter anvendelse af osmiumtetroideidfiationation efter acetonetilsætning og fordampning (2) og varmefi tionation af bakterier på et mikroskopisk objektglas (29). Disse behandlinger kunne imidlertid ikke overvejes i den foreliggende undersøgelse, da et dehydreringstrin ikke er egnet til FL o CYT cytometri., Den Gram-farvning teknik viste pålidelige resultater for alle stammer, efter 6, 12, 24 og 48 h inkubation, som næsten alle (97%) celler blev fortolket korrekt. Disse resultater er i overensstemmelse med figa – Gramfarvningsmetodens angivelser …