Antagonisme mellem penicillin og erythromycin mod Streptococcus pneumoniae in vitro og in vivo

Abstrakt

Den kombination af β-lactam-antibiotika og makrolider er ofte anbefales til den første empiriske behandling af akut lungebetændelse med henblik på at opnå aktivitet mod de vigtigste patogener. Teoretisk set kan denne kombination være uhensigtsmæssig, da det bakteriostatiske middel kan modvirke virkningen af det bakteriedræbende middel., I denne undersøgelse, er den mulige interaktion mellem penicillin og erythromycin blev undersøgt in vitro-og in vivo-mod fire kliniske isolater af Streptococcus pneumoniae med Mic for penicillin, der spænder fra 0.016 til 0,5 mg/L og af erythromycin fra 0,25 til >128 mg/L. In vitro-tid–kill kurver blev genereret med klinisk relevante koncentrationer af penicillin (10 mg/L) og erythromycin (1 mg/L), enten enkeltvis eller i kombination. Antagonisme mellem penicillin og erythromycin blev observeret for de fire isolater., In vivo interaktion blev undersøgt i musens peritonitis model. Efter intraperitoneal inokulation blev penicillin og erythromycin givet enten individuelt eller i kombination. For to af de fire isolater var dødeligheden signifikant højere i de grupper, der blev behandlet med kombinationen af penicillin og erythromycin end i de grupper, der blev behandlet med penicillin alene . Ved hjælp af musens peritonitis-model viste in vivo time–kill-kurver, at der var antagonisme mellem erythromycin og penicillin for det undersøgte isolat., Den antagonisme, der er påvist in vitro og in vivo mellem penicillin og erythromycin, antyder, at β-lactam-antibiotika og makrolider ikke bør administreres sammen, medmindre pneumokokinfektion udelukkes.

Indledning

Det er en udfordring at vælge den rigtige behandling for patienter med lungebetændelse, som ætiologi kan ikke forudsiges baseret på symptomer og kliniske fund alene, og en endelig mikrobiologisk diagnose har normalt ikke været etableret før behandling har til at starte., Streptococcus pneumoniae er den hyppigst isolerede organisme i lokalt erhvervet lungebetændelse, især hos små børn og ældre patienter, og infektionen bærer stadig en høj dødelighed.1 infektioner med Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae og Legionella spp. er også almindelige2, 3 og disse organismer er normalt ikke følsomme over for de antimikrobielle midler, der almindeligvis anvendes til behandling af pneumokokker. Derfor anbefales penicillin eller andre β-lactamer ofte i kombination med erythromycin til indledende empirisk behandling af akut lungebetændelse af ukendt ætiologi.,4

Tidligere, in vitro og in vivo synergi mellem β-lactam antibiotika såsom penicillin, ampicillin, piperacillin og cefuroxim, er blevet påvist, når kombineret med gentamicin, mod S. pneumoniae.5,6 Antagonisme in vitro er blevet demonstreret i kombinationer såsom ampicillin og chloramphenicol mod Haemophilus influenzae7 og mod gruppe B streptokokker.,8 Klinisk vigtige antagonisme er blevet rapporteret mellem penicillin og tetracyklin mod for eksempel,9,10 penicillin og erythromycin mod gruppe A streptococci11 og ampicillin, streptomycin og chloramphenicol i akut bakteriel meningitis.12 Teoretisk, empirisk initial behandling af lungebetændelse med en kombination af et β-lactam-agent og et makrolid kan også være uhensigtsmæssigt i tilfælde af pneumokok-infektion, som bakteriostatiske makrolid kan antagonisere den baktericide effekt af β-lactam.,

I den foreliggende undersøgelse har vi undersøgt den mulige interaktion mellem penicillin og erythromycin in vitro mod fire kliniske isolater af for eksempel med forskellige susceptibilities at penicillin og erythromycin.6,13 vi studerede interaktioner in vivo i musens peritonitis model.6

materialer og metoder

bakterier, medier og vækstbetingelser for musens peritonitis-model

Bakteriesuspensioner, der skal anvendes som inokula til in vitro og in vivo-test, blev fremstillet ud fra friske kulturer natten over på 5% blodagarplader fremstillet af frosne stamkulturer., Den inokulum for musen eksperimenter blev udarbejdet umiddelbart før vaccination ved at suspendere kolonier i sterile Mueller–Hinton bouillon (Statens Serum Institut, København, Danmark) og justeret til en optisk tæthed på 540 nm 0.5–1.0, hvilket giver en koncentration på ca. 108 cfu/mL, som beskrevet tidligere.13 For hvert eksperiment størrelsen af inokulum blev besluttet, efter at 10-folds fortyndinger i Mueller–Hinton bouillon, hvoraf 20 µL blev forgyldt på to 5% blood agar plader i pletter i to eksemplarer, med efterfølgende optælling af kolonier efter inkubering natten over ved 35°C i luft., Mucin (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA), et en .ymekstrakt af svinemave, blev anvendt som adjuvans til inokulering af musene og blev fremstillet som en stamopløsning 10% (w/v) i saltvand.13 umiddelbart før inokulering blev mucinopløsningerne fortyndet 1: 1 med pneumokoksuspensioner, hvilket gav en endelig mucinkoncentration på 5% (w/v).

de anvendte lægemidler var penicillin G (Leo Pharmaceutical Co., Ballerup, Danmark) og erythromycin (Sigma Chemical Co.). Penicillin G blev fortyndet i phosphat-bufret saltvand pH 6,5 0 0.,1, og erythromycin blev fortyndet i 9 mL sterilt vand og 1 mL 96% alkohol; pH af erythromycin løsning blev justeret til mellem 6.7 og 7.3.

Mikrofoner og MBCs

mikrofoner blev bestemt ved bouillon makrofortyndingsmetoden i glasrør. Alle tests blev udført i to eksemplarer, og resultaterne blev læst efter 20 h inkubation ved 35°C. bouillon macrodilution metode i glas rør blev udført med Mueller–Hinton bouillon (Statens Serum Institut), som 5% sheep blood er tilføjet et inokulum på 106 cfu/mL blev anvendt., Penicillin G blev fortyndet i to-fold skridt i Mueller– Hinton bouillon til at give koncentrationer af 0.004–64 mg/L. Den laveste koncentration af antibiotika, hvor der ikke var nogen synlig vækst blev taget som MIC. Vi brugte S. pneumoniae ATCC 49619 som en kontrolstamme til MIC-testene.

MBC blev bestemt ved subkultur af rør uden synlig vækst efter MIC-bestemmelse. Fra hvert rør blev 100 µL dyrket på agarplader indeholdende penicillinase (Leo Pharmaceutical Co .) 1000 IE / plade og kolonier blev talt efter 18-24 h inkubation ved 35 C. C., MBC blev defineret som den laveste koncentration af penicillin, der reducerede inokulum af ≥99.9%. Alle assays blev udført i to eksemplarer.

Tid–kill kurver

for At undersøge mulige interaktioner mellem penicillin og erythromycin, tid til at dræbe eksperimenter blev udført med klinisk relevante penicillin og erythromycin koncentrationer af 10 og 1 mg/L, hhv., Før time–kill-eksperimenter blev isolat 86 (erythromycin resistent) dyrket på 5% blodagarplader indeholdende erythromycin 4 mg/l (induktion af erythromycin-resistens) og på plader uden erythromycin (ingen induktion af erythromycin-resistens). Pneumokokker (106 cfu/mL) blev inkuberet i 20 mL Mueller–Hinton bouillon ved 35.C under omrystning. For at sikre eksponentiel vækst af bakterierne blev antibiotika først tilsat efter 1 time inkubation. Der blev taget prøver før tilsætning af antibiotika og 1, 2, 3 og 5 timer senere., Time-kill-kurver blev ikke forlænget yderligere, da autolyse begyndte at forekomme efter 5-6 h for alle isolater. Antallet af cfu / mL blev bestemt efter at have foretaget passende fortyndinger, og 100ll blev spredt på til 5% blodagarplader. Til ufortyndede prøver blev agarplader indeholdende penicillinase (som ovenfor) anvendt. Kolonier blev talt efter 20 timers inkubation ved 35 C. C. alle tidsdræbte eksperimenter blev udført i to eksemplarer. Variationen i kolonitællinger på de samme tidspunkter for gentagne forsøg var <0, 5 log10 pr.mL., Antagonisme, der var defineret som et betydeligt dræbende virkning (dvs >0.5 log10 cfu/mL fra 1 til 5 timer efter tilsætning af stoffer) af en kombination af penicillin og erythromycin sammenlignet med penicillin alene.14

I den tid–kill eksperimenter, vi målte muligt pH-ændringer i kolber med pH-test strimler (pH-interval 4.5–10.0; uddannet i 0,5 pH enheder; Sigma Chemical Co.).

dyreforsøg (museperitonitis model)

alle dyreforsøg blev godkendt af den nationale dyreetiske komit.., Udavlede kvindelige SSC CF-1 mus (Statens Serum Institut) i alderen 8-12 uger, vægt 28-30 g blev anvendt i grupper på fem til 36 mus. Samlet set brugte vi 88 mus til isolat 73, 89 mus til isolat 75, 88 mus til isolat 86 (uden induktion), 94 mus til isolat 86 (induceret med erythromycin som til time–kill-undersøgelser) og 89 mus til isolat 93. Musene blev holdt i bure med fem til syv mus pr.bur; de fik fri adgang til mad og vand. Pneumokoksuspension (0, 5 mL) blev inokuleret intraperitonealt via en 25-gauge sprøjte., Inokulumet indeholdt 106 cfu/mL med 5% (w / v) mucin i Mueller–Hinton bouillon. Ved anvendelse af en sådan inokula er der C. 100% dødelighed hos ubehandlede mus, som bukker under 36-48 timer efter inokulering. Antibiotika blev indgivet subkutant i nakkeområdet i et volumen på 0, 25 mL pr.13 følgende skema blev anvendt: erythromycin blev givet 90 minutter efter bakteriel inokulation, og i kombinationsgruppen blev erythromycin givet 90 minutter efter bakteriel inokulation og penicillin 60 minutter senere. Penicillin blev givet alene 150 minutter efter bakteriel inokulation., Kontrolmus fik sterilt saltvand 90 minutter efter bakteriel inokulation.

Doser penicillin og erythromycin blev valgt i henhold til Bakken ligning sigmoid dosis–effekt kurver, på en sådan måde, at penicillin alene ville forventes at resultere i c. 95% overlevelse, mens erythromycin alene var forventet at forhindre, at dødeligheden på 10% af mus. Mus inficeret med isolat 73 blev behandlet med penicillin 10 mg/mus og/eller erythromycin 100 µg / mus. Mus inficeret med isolat 75 blev behandlet med penicillin 2 mg/mus og/eller erythromycin 100 µg / mus., Mus inficeret med isolat 86 (ikke induceret) blev behandlet med penicillin 150 µg/ mus og/eller erythromycin 100 100g/mus. Mus inficeret med isolat 86 (dyrket i nærvær af sub-hæmmende koncentrationer af erythromycin før inokulering) blev behandlet med penicillin 150 µg/mus og/eller erythromycin 100 µg/mus. Mus inficeret med isolat 93 blev behandlet med penicillin 400 µg/mus og/ eller erythromycin 100 100g / mus.

blodprøver blev opnået gennem orbitalsnit efter bedøvelse af musene med CO2., Mus blev dræbt, og peritoneal vask blev derefter udført ved at injicere 2 mL sterilt saltvand intraperitonealt, massere maven og åbne bughinden for at opsamle væsken.15 blod – og peritonealvæskeprøver blev straks fortyndet, og 0, 1 mL blev belagt på 5% blodagarplader.

in vivo–tid-dræb-kurver blev konstrueret til en af pneumococcus-isolaterne (nummer 93), som viste signifikant antagonisme in vivo. Pneumokokker i peritoneum og blod blev opnået efter inokulering af 36 mus intraperitonealt med 5, 0 106 106 cfu/mL af bakteriesuspensionen., Ti minutter, 80 min, 140 min, 3 h og 5 h efter udfordring blev grupper af tre kontrolmus (inokuleret med sterilt saltvand) dræbt. Ved 140 minutter, 3 timer og 5 timer efter udfordring blev grupper af tre mus behandlet med erythromycin 90 minutter efter udfordring dræbt. Ved 3 timer og 5 timer efter udfordring blev grupper af tre mus behandlet enten med kombinationen af penicillin og erythromycin eller penicillin alene 150 minutter efter intraperitoneal infektion dræbt. Der blev udtaget prøver af blod og peritoneal vask til kvantitativ kultur af pneumokokker.,

Bestemmelse af ED50 af penicillin til individuelle eksempel

ED50, enkelt dosis, der giver beskyttelse til 50% af musene, for hver pneumokokker isolere blev bestemt ved behandling af grupper af fem mus med fordoble doser af antibiotika; overlevelse af de mus, der blev observeret i 7 dage. En gruppe på fem mus behandlet med 0, 9% NaCl blev inkluderet i hvert forsøg som en kontrol for infektionens dødelighed. For hver isolere ED50 blev beregnet efter den metode, som Reed & Muench16 og fra Bakken ligning (GraphPad Prism; GraphPad Software, Inc.,, San Diego, CA, USA). Vi udførte ingen eksperimenter for at beregne erythromycin ED50 ‘ erne, da dette tidligere er blevet gjort for stammer med lignende mikrofoner i vores laboratorium.17 Vi valgte penicillindoser, der forventes at resultere i en estimeret 95% overlevelse af musene og erythromycindoser, der forventes at resultere i en estimeret 10% overlevelse af musene. Til kombinationsbehandling blev antibiotika givet i separate injektioner.

statistik

Fishers nøjagtige test for kategoriske data blev anvendt med et tosidet 5% signifikansniveau.,

Resultater

Mic for penicillin og erythromycin og ED50s af penicillin til de fire pneumokok-stammer, der er vist i Tabellen. Dødelig infektion blev opnået med tre ud af fire isolater. Imidlertid måtte ED50 af penicillin til isolat 86 estimeres, da det kun var muligt at opnå 90% dødelighed i ED50-bestemmelseseksperimenterne.

resultaterne af time–kill-eksperimenterne er vist i Figur 1., Ved denne metode viste alle isolater in vitro-antagonisme for kombinationen af penicillin og erythromycin (figur 1a–C og e), fordi erythromycin næsten fuldstændigt hæmmede den bakteriedræbende virkning af penicillin. Når erythromycin-resistens blev induceret ved at dyrke det erythromycin-resistente isolat (nummer 86) på blodagarplader indeholdende erythromycin 4 mg/L før time–kill-undersøgelsen, blev erythromycin-antagonisme neutraliseret (figur 1d).

for alle isolater steg in vitro-dræbningseffekten af penicillin og penicillin plus erythromycin med tiden., Faldet i cfu set i kontrolflaskerne i nogle forsøg skyldtes autolyse, en almindelig observation med pneumokokker. I alle forsøg viste erythromycin alene en mindre dræbende virkning end penicillin og kombinationen. Der blev ikke observeret nogen drabseffekt i løbet af de 5 timer af inkubation i den erythromycin-resistente stamme, hvad enten de var inkuberet med erythromycin eller ej. Der blev ikke observeret ændringer i pH i kolberne indeholdende et eller begge antibiotika: pH-værdien var 7, 5 Efter 0, 1, 2, 3, 4 og 5 timers inkubation.,

i musens peritonitis-model fandt vi, at den kombinerede behandling af penicillin og erythromycin resulterede i antagonisme hos mus, der blev udfordret med isolater 75 og 93 (figur 2b og e). Der var signifikant højere dødelighed i mus behandlet med erythromycin 60 min før penicillin end i mus behandlet med penicillin alene (isolere 75: dødelighed 32/36 og 3/12, henholdsvis P < 0.05; isolere 93: dødelighed 24/36 og 3/12, henholdsvis P < 0.05) (Figur 2)., I de resterende to isolater var dødeligheden hos mus, der fik begge antibiotika, den samme som hos mus, der fik penicillin alene (figur 2a og d). Alle kontrolmus døde, når de blev inficeret intraperitonealt med pneumokokker, undtagen mus inficeret med isolat 86, for hvilken dødeligheden var 80-90%. Selv når det bakterielle inokulum af isolat 86 blev forøget til 108 cfu/mL, var der ikke 100% dødelighed.

Den laveste dødelighed blev fundet i de grupper af mus, der er behandlet med penicillin alene eller erythromycin plus penicillin i kombination efter bakteriel udfordring., Den højeste dødelighed blev observeret blandt kontrolmus eller mus behandlet med erythromycin alene 90 minutter efter pneumokokinfektion (figur 2). For at isolere 86 fandt vi, at den kombinerede behandling, der er markant bedre beskyttelse mod pneumokok-infektion end behandling med penicillin alene efter 150 min (32/35 mus i den tidligere gruppe overlevede sammenlignet med 6/12 i sidstnævnte; P = 0.009), eller erythromycin alene (32/35 og 16/36 overlevelse, hhv. P = 0.005) (Figur 2c)., Når erythromycin modstand blev fremkaldt før podning med at isolere 86, kombineret behandling, forudsat en væsentlig bedre beskyttelse end erythromycin alene (31/36 mus i den tidligere gruppe overlevede sammenlignet med 5/36 i sidstnævnte; P = 0.005).

in vivo-tid–kill-kurver til at isolere 93 viste en 1-2 log stigning i vækst af bakterier i blodet 80 min efter udfordring, sammenlignet med 10 min efter udfordring i kontrol-mus (Figur 3), der henviser til, at antallet af for eksempel i peritoneal vasker på 80 min var den samme som 10 min efter vaccination., Antallet af for eksempel dyrkes fra blodet, og peritoneal vasker på forskellige tidspunkter i de forskellige behandlingsgrupper var næsten parallelt, med 1-2 log højere cfu/mL i peritoneal vasker end i blod. Dræbning af bakterier var mest effektiv i den penicillinbehandlede gruppe med et fald i bakterievækst på henholdsvis 3 bjælker og 4 bjælker i blod og peritoneal vask. Kombinationsbehandlingen viste en lignende virkning på bakterievækst, som når erythromycin blev administreret alene (antagonisme).,

Diskussion

interaktionen mellem erythromycin og penicillin mod pneumokokker blev undersøgt med fire isolater med forskellige følsomhed over for penicillin eller erythromycin. In vitro-tid–kill kurver for erythromycin-følsomme isolere (Figur 1a, b og e), som viste en klar antagonisme mellem de to stoffer, dvs tilstedeværelsen af erythromycin helt hæmmet bakteriedræbende aktivitet af penicillin og den resulterende kurve svarer til den langsomme hæmmende aktivitet erythromycin alene., Inhiberingen af effekten af penicillin (som er sur) kunne have været på grund af stigninger i pH forårsaget af erythromycin (som er alkalisk). Men pH målinger i kolber med narkotika kombination viste ingen ændringer i pH-værdien. Den antagonistiske effekt blev også set i uninduced erythromycin resistente pneumokok-isolat (86), mens induktion af udtryk af resistensgen erythromycin forhindret, at den hæmmende effekt af erythromycin og dens antagonistiske aktivitet på penicillin., Disse resultater tyder tydeligt på, at det er den inhiberende aktivitet af makrolidet på væksten eller celledelingen af bakterierne, der er hovedårsagen til antagonisme mod penicillin, som kun kan virke på bakterier, der er i vækstfasen og producerer en cellevæg.15 Denne bakteriostatiske aktivitet af erythromycin og dens hæmmende virkning på penicillin var tydeligt synlig i In vivo-forsøgene.,

for at vurdere den mulige interaktion mellem de to stoffer in vivo, vi valgte musen peritonitis model, der tidligere har været nyttige i at demonstrere samspillet mellem antibiotika,6, og som også gør det muligt at studere medicin handling på bakterier, ved at udføre in vivo tid–kill forsøg på organismer i peritoneum og/eller blod.17 doser penicillin og erythromycin blev valgt i henhold til Hill–ligningen sigmoid dosis-effektkurver, på en sådan måde, at penicillin alene forventes at resultere i ca., 95% overlevelse, mens erythromycin alene kun ville være i stand til at forhindre dødelighed hos 10% af musene. Med disse doser ville en virkning af erythromycindosis uden indflydelse af en efterfølgende penicillindosis resultere i en dødelighed, der udelukkende bestemmes af makrolidets aktivitet. Den antagonistiske aktivitet af de to lægemidler blev efterfølgende bekræftet ved time–kill-kurver in vivo for at skyldes den samme væksthæmmende aktivitet af erythromycin som påvist in vitro., Betydningen af induktion af erythromycin modstand i erythromycin resistente isolere (antal 86) blev også påvist in vivo: induktion med erythromycin signifikant nedsat overlevelse på trods af erythromycin behandling sammenlignet med overlevelse, efter erythromycin behandling af uninduced eksempel.

Med et erythromycin-modtageligt isolat (nummer 73) var det ikke muligt at udvise antagonisme in vivo med den anvendte metode. Der kan være flere forklaringer på dette., Muligheden for, at ikke alle pneumokokker reagerer på samme måde som de to anvendte lægemidler, synes usandsynlig, især når aktiviteten var lige påviselig in vitro. Det er mere sandsynligt, at situationen i vivo er forskellige for de forskellige stammer, fx virulens pneumoccci afhænger af en række faktorer, der er svært at standardisere, som den type og størrelse af den kapsel, andre virulensfaktorer, der er forbundet med membran eller giftstoffer, eller væksten adfærd i vivo, som er meget variabel, for eksempel., Det er sandsynligt, at vi kunne have demonstreret antagonisme in vivo med isolate 73, hvis vi havde ‘titreret’ inokulumet og timingen af de to lægemidler i forhold til hinanden, men dette ville kræve et for stort antal dyr., Klar og tydelig demonstration af den interaktion mellem to lægemidler mod mindst to pneumokok stammer både in vitro og in vivo, som blev demonstreret af stigningen i dødelighed samt ved ændringer i in vivo-tid–kill kurver, er rigelig dokumentation for en effekt, og bør advare klinikere mod brugen af disse to lægemidler sammen til behandling af pneumokokker.

den kliniske betydning af antagonisme mellem et bakteriedræbende lægemiddel, såsom penicillin eller ampicillin, og en bakteriostatisk proteinsynteseinhibitor, f. eks., tetracyclin, erythromycin eller chloramphenicol er blevet påvist i flere undersøgelser.7-12, 18 antagonisme er blevet bekræftet in vivo i en eksperimentel undersøgelse med penicillin og chloramphenicol mod pneumokok meningitis hos hunde.19 på trods af denne tidlige erfaring med sådanne lægemiddelkombinationer anbefales kombinationen af penicillin og erythromycin selv i standard lærebøger som empirisk behandling i lungebetændelse af ukendt ætiologi.4 lægemiddelkombinationen er især valgt til at omfatte pneumokokker og Legionella spp.,, som anses for at være vigtige og dødelige ætiologiske midler i lungebetændelse. Det er vanskeligt at vide, om resultaterne af den foreliggende undersøgelse er direkte anvendelige i den kliniske situation. I den kliniske situation ville suboptimale doser erythromycin normalt ikke anvendes, men med hæmmet virkning af penicillin kan man være nødt til at stole på den bakteriostatiske virkning af erythromycin, hvis pneumococcus er erythromycin-modtagelig. Det vides ikke, om den inducerbare virkning af erythromycin, der er påvist i den foreliggende undersøgelse, også finder sted i det pneumoniske fokus hos mennesker.,

Som konklusion har den foreliggende undersøgelse vist antagonisme mellem penicillin og erythromycin mod tre erythromycin-følsomme isolater af pneumokokker in vitro. Denne antagonisme forekom også med to af isolaterne in vivo i en simpel eksperimentel model med mus. Når erythromycin-resistens ikke blev induceret, blev antagonisme også påvist in vitro for det erythromycin-resistente pneumokokkisolat, men induktion med erythromycin før inokulering udslettede den antagonistiske virkning.

Den tekniske ekspert bistand af Anja Borum og Jytte Mark Andersen er i høj grad værdsat., Foreløbige data præsenteret i sin endelige form i dette manuskript blev præsenteret på Tredive-Syvende Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Toronto, Ontario, Canada, 28 September–1 oktober 1, 1997 (plakat A-29).