… na bázi BactoScan FC, který používá ethidiumbromid k barvení bakterií v mléce, poskytuje výsledek po 8 min (5, 30). Dříve byla popsána také průtok cytometrická technika pro měření TBC v syrovém a ultrahigh – teplotním mléce se skvrnou SYTO BC (16). Tyto techniky jsou však buď velmi specifické, detekují pouze jeden druh, nebo nespecifické, detekují všechny bakterie., Flow-cytometrické techniky pro diferenciaci bakterií v mléce do větších skupin, jako jsou gram-pozitivní a gramnegativní bakterie, dosud nebyly popsány. Gram barvení byl původně popsán v roce 1883 Christian gram kolega Carl Friedlander, dělení bakterií do dvou skupin, A opět v roce 1884 Christian Gram (12, 14). Konvenční gram-barvení postup zahrnuje skvrny crystal violet a safranin. Tepelně fixované buňky na skluzu jsou obarveny modrofialovou krystalovou fialkou a poté jsou ošetřeny ethanolem., Gramnegativní bakterie jsou odbarveny ethanolem, zatímco grampozitivní bakterie zůstávají obarveny krystalovou fialkou. Dále se safranin používá k potlačení gramnegativních bakterií, což dává této skupině růžový vzhled. Byly hlášeny četné alternativní přístupy k identifikaci Gram reakce. Široce se používá metoda, při které je kolonie bakterií podrobena 3% hydroxidu draselnému. Vysoká koncentrace hydroxidu draselného lyzuje gramnegativní bakterie a uvolňuje DNA z buněk, což lze potvrdit vytažením viskózního řetězce z kolonie (15, 26)., Byla popsána alternativní Gram-barvicí technika s fluoresceinem konjugovaným lektinem pšeničných klíčků aglutinin (WGA) pro kombinovanou epifluorescenci a fázově kontrastní mikroskop (29). WGA se váže na N-acetylglukosamin ve vrstvě pep-tidoglykanu buněčné stěny. Gramnegativní bakterie mají vrstvu lipopolysacharidu pokrývající buněčnou stěnu, a proto nejsou obarveny WGA, zatímco grampozitivní bakterie jsou obarveny WGA, protože nemají lipopolysacharidovou vrstvu., Tyto výsledky ukázaly necitlivost na věk kultury, což znamenalo, že tato skvrna může být použita přímo na vzorcích bez precultivace vzorku. Modi fi ed verze techniky WGA byla popsána pro bakterie nalezené v nepotravinářském prostředí, ve kterém jsou bakterie imobilizovány na Fi lter, promyty a poté obarveny WGA (11). Byly také navrženy některé Gram-barvicí techniky pro fl ow cytometrii. Jeden používá fluorescenční lipofilní skvrnu rho-damine 123, která selektivně skvrny gram-pozitivní bakterie., Lipopolysacharidová vrstva gramnegativních bakterií předem odvádí vstup rhodaminu 123 (1, 28). Další podobná technika kombinuje dvě fl uorescenční dna vazebné skvrny, SYTO 13 a hexidium jodid (HI). SYTO 13 je membránově propustná skvrna a HI je blokována lipopolysacharidovou vrstvou gramnegativních bakterií, a proto je propustná pouze pro gram-pozitivní bakterie a gramnegativní bakterie s de-stabilizovanou lipopolysacharidovou vrstvou (22). Nicméně, vzhledem ke křehké povaze lipopolysacharid vrstvy, tyto techniky jsou věřil být vhodné pro neobdělávané vzorků., Cílem této práce bylo vyvinout Gram-barvicí techniku založenou na barvení bakterií WGA a HI a následovanou fl ow cytometrickou detekcí. Technika byla hodnocena na mléko-spojené bakterie (19, 20) ve stacionární fázi a po 6, 12 a 48 hodinách inkubace v laboratorní média. Kromě toho byla metoda testována na staničních Ary-fázových kulturách, které byly skladovány po dobu 24 hodin při teplotě Ϫ 18 ° C a po dobu 14 dnů při teplotě 5 ° C.nakonec byla tato technika aplikována na hromadné tankové mléko špičaté známými bakteriemi., Technika diferenciace gram-pozitivních a gramnegativních bakterií v hromadném tankovém mléce bez precultivace bude konečným AP-plikací. Obrázek 1 ukazuje účinek koncentrace KCl na vazbu WGA na grampozitivní bakterie m.luteus a s. uberis , když jsou bakterie obarveny samotným WGA, s výjimkou HI. V histogramech je šum vidět vlevo, kde se nahromadily události s nízkou intenzitou fl uorescence (třaskavý byl použit k odříznutí většiny hluku)., Když jsou bakterie obarveny, aby se odlišily od hluku, objeví se jako vrchol zcela oddělený od hluku. Pomocí 0 M KCl, žádný ze dvou bakterie byly obarveny dost, aby je oddělili od hluku. Při použití 1 M KCl byla u obou bakterií pozorována zvýšená intenzita FL uores-cence. M. luteus byl pak oddělen od hluku a s.uberis jen mírně překročil hluk. Zvýšení koncentrace KCL na 3 M dále zlepšilo vazbu (vyšší intenzity fl uorescence) WGA na tyto kmeny bakterií, zejména pro M .luteus., Mikroskopická pozorování ukázala, že gram-pozitivní bakterie byly obarveny WGA, zatímco gram-negativní bacte-ria nebyly obarveny WGA. Ahoj obarvil grampozitivní i gramnegativní bakterie. Obrázek 2 ukazuje příklad barvení směsi (1: 1) gram-pozitivního m.luteus a gramnegativní E. coli s WGA i HI. V důsledku barvení se objevil m. luteus se zeleným povrchem (WGA) a červenou cytoplazmou (HI), zatímco E.coli se objevil pouze s červenou cytoplazmou. Izometrické grafy cytometrických analýz Kultur e. coli, m., luteus a směs (1:1) z nich jsou znázorněny na obr. 3. Měření samotné E. coli (obr. 3A), 100% událostí bylo přítomno v gramnegativní oblasti. Pouze pro M. luteuse (obr. 3B), 99% událostí bylo v gram-pozitivní oblasti a 1% událostí vstoupilo do gramnegativní oblasti. Když byly smíchány kultury E.coli a m. luteus (obr. 3C), 50% událostí bylo pozorováno v každé oblasti. Každý z 12 bakteriálních kmenů byl měřen ve dvou vyhotoveních po 6,12, 24 a 48 h inkubace. Z každého měření bylo pro výpočty použito 100 událostí. Na Obr., 4 je prezentován sestavený pozemek, který zahrnuje všech 800 událostí pro každý z 12 bakteriálních kmenů testovaných během 48 h inkubace (celkem 9 600 událostí). Každý bakteriální kmen je prezentován s výraznou barvou. Je zobrazena vypočtená nejlepší linie pro oddělení gram-pozitivních a gramnegativních bakterií. Celkově linka zajistila, že 97% událostí bude správně interpretováno. Procenta buněk správně interpretovaných pro jednotlivé kmeny byla kalkulována a jsou uvedena v tabulce 1. Pro e. cloacae , E. coli , k. oxytoca , L. lactis, m. luteus, s. aureus, s. agalactiae, s., dys-galactiae a s. uberis byly téměř všechny buňky ( Ͼ 96%) správně interpretovány pro jakoukoli inkubační dobu. U B. cereus , P. fl uores – cens a P. putida bylo po 12 a 24 h inkubace interpretováno přibližně 93% buněk , zatímco po 6 a 48 h inkubace bylo správně interpretováno pouze 75 až 89% buněk. V tabulce 2 jsou uvedeny výsledky fl ow-cytometrických analýz cul-tures podrobených různým podmínkám skladování., Když byly kultury skladovány při teplotě 5 ° C po dobu 14 dnů, zdálo se, že technika barvení je ve věku kultury, zejména u gramnegativních bakterií. Průměrné procento správně interpretovaných buněk bylo 86%. Pro E.coli , m. luteus , s. agalactiae , s. dysgalactiae a s. uberis byla většina buněk ( Ͼ 97%) správně interpretována. U B.cereus , e. cloacae , k. oxytoca , L. lactis a s. aureus bylo správně interpretováno 76 až 89% a u P. fl uorescens a P. putida byly Fi gures 58 a 68%., Zmrazení se nezdálo, že by v fl uence technika skvrna-ing. Po skladování při teplotě Ϫ 18 ° C po dobu 24 hodin bylo 98% buněk správně interpretováno pro e .cloacae, E. coli , k. oxy – toca , L. lactis , P. putida , s. aureus , s. agalactiae , s. dysgalactiae a s. uberis. U B. cereus a P.fl uorescens byly Fi gures 83 A 82%. Obrázek 5 ukazuje izometrické grafy fl ow-cytometrických análních yses s. aureus a E. coli přidaných do volně loženého mléka. Pro s. aureus (obr. 5A), 98% událostí bylo v gram-pozitivní oblasti a 2% událostí vstoupilo do gramnegativní oblasti., Pro E. coli (obr. 5B), 96% událostí bylo v gramnegativní oblasti a 4% událostí vstoupilo do oblasti gram – posi-tive. Příspěvek z přírodních bakterií přítomných v mléce představoval méně než 0,1%. Přidání vysoké koncentrace KCl do barvicího roztoku zlepšilo schopnost WGA skvrnit gram-pozitivní bakterie. Možným vysvětlením je, že gram-pozitivní bakterie mají teichoové kyseliny připojené kolmo k jejich buněčným stěnám, které u některých gram-pozitivních bakterií mohou blokovat přístup WGA k buněčné stěně., Když koncentrace KCl je nízký, struktura teichoic kyselin je tuhé, ale zvýšením koncentrace KCl, struktura bude uvolněna jako draselné ionty eliminovat negativní náboje na teichoic kyselin, což způsobuje konstrukce na kolaps (8, 9). Složení a struktura teichoových kyselin se liší mezi gram-pozitivním spe-cies (24), což může vysvětlit, proč zvýšení koncentrace KCL z 1 na 3 M mělo větší účinek na M .luteus než na s. uberis. V současné práci bylo použito 3 M KCl k maximalizaci vazby WGA na gram-pozitivní bakterie., Techniky eliminace organizace teichoových kyselin byly předběžně hlášeny pouze pro mikroskopické aplikace. Tyto techniky zahrnují použití osmium tetroxide Fi xation fol-lowed přidáním acetonu a odpařováním (2) a teplo fi Xa – tion bakterií na mikroskopickém snímku (29). Tato léčba však v této studii nemohla být zvážena, protože dehydratační krok není vhodný pro fl ow cytometrii., Technika gram-barvení ukázala spolehlivé výsledky pro všechny kmeny po 6, 12, 24 a 48 h inkubace, pro které byly správně interpretovány téměř všechny (97%) buňky. Tyto výsledky con-form na Fi ndings metody WGA gram-barvení re-portován …