1 Úvod
Integrální membránové proteiny tvoří velkou část genomu mnoha organismů—přibližně 25% z lidského genomu—a plní pestrou škálu funkcí, včetně klíčových kroků v komunikaci buňky s okolím., Protože jejich biologický a terapeutický význam (Almén, Nordström, textařka, skladatelka, & Schiöth, 2009), membránové proteiny se zaměřuje na základní a aplikovaný biofyzikální výzkum charakterizovat tří-dimenzionální struktury, dynamiky a interakcí v nativní-jako prostředí.,
spektroskopie řešení-stav NMR hrála klíčovou roli v biofyzikálních studiích membránových proteinů, protože site-specific dynamické a interakční informace poskytované těmito přístupy pěkně doplňují strukturální data získaná z rentgenové difrakce, kryo-EM a výpočetní analýzy (Cuniasse, Tavares, Orlova, & Zinn-Justin, 2017; Opella & Marassi, 2017)., Základem těchto studií je několik 2D „otisků prstů spektra,“ většinou 15N/1H HSQC (heteronuclear single quantum coherence) spectra (pro páteř amid plus Trp, Asn a Gln sidechains) nebo methyl 13C/1H HMQC (heteronuclear multiple-quantum coherence) spektra pro sidechain methyl skupiny (Pellecchia et al., 2008). Tyto methyl-režie experimenty jsou zvláště výhodné pro velké, pomalé-omílání membránový protein/lipid komplexy; experimentů zaměřených na jiné, sidechain a mainchain stránky byly úspěšně použity stejně., NMR experimenty mohou poskytnout informace o protein dynamics přes mnoho časových lhůtách, a to od rychlé (ps–ns) sidechain pohyby pomalé konformační změny (µs–ms) (Kasinath, Ostré, & Hůlka, 2013; Liang & Tamm, 2016; Palmer, 2012; Hůlka, Moorman, & Harpole, 2013)., Mnoho z těchto dynamických experimentů, často používajících methylové skupiny sidechain jako sondy, bylo přizpůsobeno a vyvinuto pro velké biomolekulární systémy a může být použito pro membránové proteiny (Rosenzweig & Kay, 2014; Sun, Kay, & Tugarinov, 2011; Tugarinov, Hwang, Ollerenshaw, Tugarinov, div id=“b8d22c1fbd“ > Kay, 2003).
zvláštní výhodou NMR stavu roztoku je, že proteiny jsou studovány ve stavu nativního roztoku, kde se mohou interkonvertovat mezi více konformacemi., Nicméně, membránové proteiny, musí být rozpuštěny ve vhodném membrány mimetické, která udržuje nativní strukturu a dynamiku. Různé možnosti zahrnují micel detergentu, amphipols, bicelles, nanodiscs, SMALPs, a lipidové váčky, z nichž každý má své vlastní výhody a nevýhody (Liang & Tamm, 2016, 2018; Zhou & Kříž, 2013). Často je nutné testovat různé strategie solubilizace pro daný vzorek bílkovin pro stabilitu, intenzitu a rozlišení signálu a nativní strukturu/aktivitu., Dvě důležité úvahy pro všechny membránové mimetiky jsou (1) jednotná a malá velikost částic a (2) vysoký rozsah deuterace.
deuterace na vysoké úrovni, a to jak v membránové mimetice, tak v samotném proteinu, je rozhodující pro snížení počtu 1h signálů přítomných ve spektrech (včetně těch z lipidů, které mohou být intenzivní) a pro zlepšení relaxačních charakteristik zbývajících NMR-aktivních otočení ve vzorku., Zatímco deuterace je možná pro membránovou mimetiku prostřednictvím nákupu / syntézy deuterovaných sloučenin, nahrazení 1h 2h v proteinech vyžaduje biosyntetickou inkorporaci. Pro páteřní experimenty v eukaryotické expresní systémy, lze popsat jednotně s 15N pozorovat všechny amidy (Eddy et al., 2018; Opitz, Isogai, & Grzesiek, 2015) nebo přidáním specificky značených aminokyselin (Isogai et al., 2016)., U methylových skupin lze poskytnout buď vhodně značené aminokyseliny nebo prekurzory aminokyselin (zejména alfa-keto kyseliny) růstovým médiím pro přístup k různým vzorcům označování v postranních řetězcích několika aminokyselin (Kofuku et al., 2014, 2018).,ind isoleucin δ1 methyl skupiny obzvláště užitečné vzhledem k (1) hojnost Ile reziduí v integrální membránové proteiny včetně GPCRs (Ulmschneider & Sansom, 2001), (2) daleko dopředu, 13C posun isoleucin δ1 methylové skupiny , jejich uvedení v obzvláště nezalidněné oblasti 2D 13C/1H spekter, (3) nedostatek muset stereospecifically přiřadit tyto methylové skupiny, na rozdíl od Val a Leu, a (4) přítomnost více, volně otočná vazby mezi methylovou skupinu a bílkovin páteř, poskytuje značnou nezávislost dynamics na těchto stránkách (Kasinath et al.,, 2013).
zatímco mnoho z výše uvedených strategií označování bylo dobře vyvinuto pro E. coli, mnoho integrálních membránových proteinů může být vyjádřeno pouze na vysokých úrovních v eukaryotických hostitelích. Mezi nimi je methylotrofní kvasnice Pichia pastoris vhodným hostitelem pro heterologní expresi a izotopové označování eukaryotických membránových proteinů (Clark, Dikiy, Rosenbaum, & Gardner, 2018)., Mezi výhody Pichie patří rychlost genetické manipulace, vysoké výnosy rekombinantních proteinů, existence posttranslační modifikace (PTM) a chaperonových strojů nezbytných pro eukaryotické membránové proteiny a schopnost růst na definovaných minimálních médiích umožňujících perdeuteraci (Cereghino & Cregg, 2000; Morgan, Kragt, & Feeney, 2000). Jednotné izotopové značení v Pichii bylo dobře zavedeno (Morgan et al., 2000; Pickford & O ‚ Leary, 2004)., Rozšířili jsme tuto práci tím, že prokáže, 13C, 1H označování isoleucin δ1-methyl skupiny v perdeuterated pozadí přidáním označené α-ketobutyrate (~ 50% značení, ~ 90% deuteration) vysoce deuterovaný růst média (Clark et al., 2017, 2015). Naproti tomu současné označování skupin leucinu δ-a valinu γ-methyl s α-ketoisovalerátem je neefektivní, ale lze jej dosáhnout přidáním značeného valinu přímo do růstového média nebo úpravou kultivačních podmínek (Clark et al., 2015; Suzuki et al., 2018; Zhang et al., 2017)., Pichia může snadno přijmout další aminokyseliny z médií, s obecnou korelací mezi účinností vychytávání a energetickými náklady na syntézu tohoto typu aminokyselin de novo (Heyland, Fu, Blank, & Schmid, 2011). Nicméně, po absorpci do buněk, označené aminokyseliny mohou být podávány do metabolických drah (Solà, Maaheimo, Ylonen, Ferrer, & Szyperski, 2004), ředění signál požadované aminokyseliny a komplikuje analýzu dat pomocí izotopových zakódování., Alternativně, auxotrophic kmeny mohou být vyvinuty pro označování specifických aminokyselin; nicméně, péče musí být přijata, aby potvrdil, že off-cíl účinky v jiných metabolických drah nevznikají (Whittaker, 2007).
zde poskytujeme podrobné protokoly potřebné k vytvoření takových proteinů integrální membrány značené u-2h (13C, 1h-Ile δ1 methyl) nadměrnou expresí v Pichii pomocí receptoru lidského adenosinu A2A jako modelového systému., Dále jsme podrobně, jak takové vzorky mohou být použity v řešení NMR studií, od získání jednoduchý 13C/1H HMQC spectra, přes chemický posun úkoly pomocí site-directed mutageneze, analýzy 1H–1H cross-relaxace měření rychle sidechain dynamiku.