Geneticky kódovatelný bioluminiscenční systém z hub

• bioluminiscence
• houbová luciferinová biosyntéza
• houbová luciferáza

bioluminiscence je přirozený jev světelné emise vyplývající z oxidace substrátu, luciferinu, katalyzovaného enzymem, luciferázou. Různé druhy jsou bioluminiscenční povahy (1); pro mnohé z nich je schopnost vyzařovat světlo určujícím rysem jejich biologie (2⇓-4). Umělá integrace přírodních bioluminiscenčních reakcí do živých systémů se také stala zpravodajským nástrojem široce používaným v molekulární a buněčné biologii (5, 6)., Přírodní bioluminiscenční systémy však zůstávají špatně charakterizovány na biochemické úrovni, což omezuje rozšířenější aplikaci. Bylo popsáno pouze 9 luciferinů a 7 genových rodin luciferázy (7, 8) z nejméně 40 bioluminiscenčních systémů, o nichž se předpokládá, že existují v přírodě (9). V plném rozsahu byla popsána pouze jediná biochemická kaskáda začínající od rozšířeného metabolitu k luciferinu (10). Popsaná cesta je bakteriální a má omezené použití v eukaryotách (11)., Žádný z eukaryotických bioluminiscenčních systémů nebyl dostatečně podrobně popsán k vyjádření v jiném organismu nebo k vytvoření umělých autonomně bioluminiscenčních organismů. Zde popíšeme funkci a vývoj klíčových genů zodpovědných za bioluminiscenci houby Neonothopanus nambi a ukázat, že výraz houbových genů je dostačující pro engineer samostatně bioluminiscenční eukaryot.

přibližně 100 druhů hub z řádu Agaricales vyzařuje světlo využívající stejnou biochemickou reakci (12)., Ačkoli ekologická role jejich bioluminiscence není plně pochopena, existují důkazy, že by houby mohly být použity k přilákání hmyzu distribuujícího spóry (13). Houbové bioluminiscence byl známý využít alespoň čtyři komponenty: molekulární kyslík; luciferin, který byl nedávno identifikován jako 3-hydroxyhispidin ; a dvě dosud nepopsané klíčových enzymů, NAD(P)H-dependentní hydroxylázy a luciferase (15, 16).

k identifikaci enzymů houbové bioluminiscenční dráhy jsme se nejprve zaměřili na izolaci genu luciferázy. Vyjádřením N., knihovna nambi cDNA v Pichia pastoris a postřik agarových desek syntetickým 3-hydroxyhispidinem jsme identifikovali a sekvenovali luminiscenční kvasinkovou kolonii exprimující Gen luciferázy (si Dodatek, fíky. S1 a S13). N. nambi luciferase, nnLuz, je protein 267-aa (SI Dodatek, obr. S2) a nemá popsané homologů nebo výraznou sekvenční podobnost k zachovány proteinových domén, což představuje román protein rodinu.

geny kódující enzymy, které syntetizují sekundární metabolity, jsou často seskupeny v houbových genomech (17)., Předpokládali jsme, že to může být případ enzymů bioluminiscenční kaskády, protože se předpokládá, že kaskáda je zachována mezi bioluminiscenčními houbami (12). Hledali jsme tedy geny související s biosyntézou luciferinu v blízkosti genu luciferázy v genomu n. nambi. Kromě N. nambi, jsme také sekvenován genom a transcriptomes z bioluminiscenční hub Neonothopanus gardneri, Mycena citricolor, a Panellus stipticus a ve srovnání s nimi veřejně dostupné genomové sekvence bioluminiscenční a nonbioluminescent houby (18, 19)., Zjistili jsme, že luciferáza je členem konzervované genové klastry, která zahrnuje alespoň dva další geny: h3h a hisps (obr. 1 B A C a datové sady S1-S3).

Gen h3h vykazoval sekvenční podobnost s 3-hydroxybenzoátovými 6-monooxygenázami, enzymy, které katalyzují oxidaci 3-hydroxybenzoátu pomocí NADH a molekulárního kyslíku. Tato reakce je totožná s reakcí, která přeměňuje hispidin na luciferin (obr. 1A); předpokládali jsme tedy, že genové kódy h3h pro hispidin-3-hydroxylázu (H3H), enzym odpovídající předpokládané hydroxyláze (15)., Klonovali jsme gen od N. nambi a zjistili jsme, že kolonie P.pastoris exprimující jak nnluz, tak nnh3h emitují světlo při postřiku luciferinovým prekurzorem hispidinem, na rozdíl od kontrolních kolonií exprimujících samotný nnluz (si Dodatek, fíky. S14 a S17) – potvrzující, že nnH3H převádí hispidin na luciferin.

Gen hisps (obr. 1C) kóduje člena rodiny polyketidové syntázy, enzymy, které produkují sekundární metabolity v různých organismech napříč stromem života (20)., Polyketide synthases obvykle přidat malonyl složek na rostoucí uhlíkové řetězce; to znamená, že α-pyrone povahu hispidin navrhl, že jeho biosyntéza může být provedena polyketide syntázy z kávová kyselina o dva cykly, z toho z malonyl jednotky následuje lactonization (Obr. 1a a SI Dodatek, obr. Galaxie). Velké modulární polyketidové syntázy vyžadují posttranslační modifikace pro svou aktivitu (21), jako je přenos fosfopantetheinylové skupiny na konzervovaný serinový zbytek proteinové domény acyl carrier., Abychom otestovali, zda Gen hisps může produkovat luciferinový prekurzor v heterologním systému, integrovali jsme geny hisps, nnluz a nnh3h spolu s genem Aspergillus nidulans 4′-fosfopantetheinyltransferázy npga do genomu P.pastoris. Při kultivaci v médiu obsahujícím kyselinu kofeinovou kvasinky exprimující všechny čtyři geny vyzařovaly světlo viditelné pouhým okem(obr. 3A), zatímco u kmenů postrádajících geny npgA nebo hisps nebyla pozorována žádná významná produkce světla (si Dodatek, fíky. S15 a S17)., Hispidin proto katalyzuje syntézu hispidinu z kyseliny kofeinové a uzavírá řetězec reakcí („cyklus kyseliny kofeinové“) ze společného buněčného metabolitu se známou biosyntézou na eukaryotický luciferin.

u některých bioluminiscenčních druhů hub genomická shluk pojme jeden nebo dva další geny (obr. 1C) : jeden patřící do rodiny cytochromu P450 a druhý patřící do rodiny hydroláz fumarylacetoacetátu., Druhé (cph) pravděpodobně kóduje caffeylpyruvate hydrolázy (Dataset S4) podílí se na oxyluciferin recyklaci, v souladu s caffeylpyruvate, plísňové oxyluciferin, že hydrolyzuje na caffeate a pyruvát o hydrolázy přítomen v houbové surové extrakty (22).

Zachování genů naznačuje, že, na rozdíl od jiných skupin bioluminiscenční organismy (23), bioluminiscenci vyvinul v houbách pouze jednou, s luz, h3h a hisps geny vznikající prostřednictvím genových duplikací. Rekonstruované fylogenetické stromy pro geny luz, h3h a hisps (SI apendix, fíky., S4-S6) a druhový strom řádu Agaricales (obr. 2) odhalte vývoj kaskády bioluminiscence u hub. Primární Luz enzym houbové bioluminiscenční Kaskády se objevil duplikací genu na bázi Agarikálů, po níž následovala duplikace h3h a hisps o několik milionů let později. Zajímavé je, že mnoho druhů ve velkém kladu kódujícím Hisp jsou nonbioluminiscenční a homologům hips u bioluminiscenčních druhů chybí dvě domény, domény ketoreduktázy a dehydratázy (SI Dodatek, Obr. S6)., Je pravděpodobné, že ztráta těchto funkčních domén u společného předka bioluminiscenčních druhů upřednostňovala produkci α-pyronů rodovými hispy, případně poskytovala poslední krok pro vznik bioluminiscence.

genová klastra se po získání bioluminiscence nadále dynamicky vyvíjela. Nejméně šest nezávislých úplných nebo částečných genových ztrát genů z genomického klastru vedlo k sekundární ztrátě bioluminiscence(obr. 2). Gen cph byl vložen do clusteru v nemycenoidním clade, možná dvakrát (obr. 1)., Tento mozaikový vzor připomíná evoluční historii fluorescenčních proteinů (24), další vizuálně relevantní proteinovou rodinu s nejasnou biologickou úlohou, a může naznačovat, že selektivní výhoda poskytovaná bioluminiscencí u hub závisí na specifickém nebo přechodném ekologickém kontextu.

komplexní adaptace mohou být zdrojem biotechnologicky relevantních řešení., Kromě odhalení povahy základních fotochemických procesů a evoluce proteinů patří luciferázy mezi primární typy reportérských genů používaných v různých výzkumných potrubích, metodách diagnostiky a environmentálních aplikacích (5, 6, 25). Abychom zjistili, zda houbová bioluminiscenční cesta může poskytnout reportérské geny, charakterizovali jsme nnLuz in vitro a testovali jsme jeho schopnost produkovat světlo v heterologních systémech.

nnluz protein se skládá z 267 aminokyselin a má molekulovou hmotnost asi 28,5 kDa(SI Dodatek, obr. S7)., Ačkoli jeho buněčná lokalizace in vivo zůstává neznámá, protein má předpovězenou N-terminální transmembránovou šroubovice, která je v souladu s kolokalizací luciferázové aktivity s nerozpustnými buněčnými frakcemi v předchozích studiích (22). Při vyjádření v p. pastoris byl nnLuz spojen s mikrozomální frakcí(si Dodatek, obr. S8) a vyzařované zelené světlo s maximem při 520 nm a spektrem shodným s spektrem n.nambi mycelium (obr. 3a a SI Dodatek, obr. S9). Rekombinantní nnluz optimálně vyzařuje světlo kolem pH 8.,0 a mírné teploty, ztrácí svou aktivitu při teplotách nad 30 °C (si Dodatek, obr. S10).

pro testování potenciálu nnluz jako reportérského genu v heterologních systémech jsme testovali jeho expresi v Escherichia coli, P. pastoris, raných embryích Xenopus laevis a lidských buňkách., Přestože se luciferáza nahromadila většinou v inkluzních tělech, když byla vyjádřena v bakteriích(SI Dodatek, obr. S7), všechny testované buňky a organismy exprimující nnluz divokého typu byly jasně bioluminiscenční, když byl do média přidán 3-hydroxyhispidin (obr. 3 A SI Dodatek, obr. S11 a S22). Nnluz jsme také kvalitativně porovnali s luciferázou z firefly Photinus pyralis v celotělovém zobrazovacím nastavení nádorových xenograftů u myší. My s. c., implantované stejné množství myších buněk karcinomu tlustého střeva exprimujících buď nnluz nebo světlušku luciferázu pod stejným promotorem, vstříklo směs světlušek a houbových luciferinů i. p. a získalo téměř identické signály z implantátů (obr. 3C).

nakonec jsme se zaměřili na testování, zda lze dosáhnout biosyntézy luciferinu u organismů postrádajících biosyntézu kyseliny kávové. Zavedení tří dalších genů kódujících enzymy biosyntézy kyseliny kofeinové z tyrosinu, Rhodobacter capsulatus tyrosin amoniakové lyázy a dvou E., coli 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase součásti (26), do genomu P. pastoris kmen nesoucí npgA, hisps, h3h a luz geny za následek napětí, které bylo samostatně bioluminiscenční když se pěstuje ve standardní droždí střední (SI Dodatek, Fíky. S12 a S16).

Tak, za všech testovaných podmínek, wild-type N. nambi luciferase je funkční v heterogenní systémy, umístí sebe jako nadějný reportér genu, a plísňové luciferin mohou být syntetizovány z aromatických aminokyselin v jiných eukaryot., Kromě toho je houbový luciferin ve vodě rozpustná a propustná sloučenina pro buňky a její reakce vyzařující světlo nezávisí na dostupnosti ATP, což činí houbový bioluminiscenční systém atraktivním pro řadu aplikací v biomedicínském zobrazování. Kromě toho mohou být různé analogy luciferinu použity ke zvýšení emisí světla a naladění jeho spektra, což zlepšuje pronikání světla v aplikacích zobrazování hlubokých tkání (22).

Na závěr představujeme enzymatickou kaskádu, která vede k emisím světla v houbách, což je eukaryotický bioluminiscenční systém se známou biosyntézou luciferinu., Ukázali jsme, že luciferin je syntetizován ze svého prekurzoru hispidin N. nambi H3H a že hispidin může být přímo syntetizován hispidin syntázou z kyseliny kávové, rozšířeného buněčného metabolitu s účinnou biosyntézou, která byla dosažena v různých organismech, včetně průmyslově relevantních kvasinkových kmenů (26)., Jen dva enzymatické kroky od běžných metabolických drah, plísňové systém má vysoký potenciál pro syntetické biologie je vytvořit samostatně zářící zvířat a rostlin: pokusy vyvinout takové organismy byly doposud omezeny špatný výkon v eukaryot bakteriální bioluminiscenční systém, pouze systém, pro který luciferin biosyntéza byl známý (27, 28).

rekonstituce houbové bioluminiscenční dráhy v eukaryotických organismech by mohla umožnit aplikace, kde tkáně nebo organismy hlásí změny ve svém fyziologickém stavu s autonomní emisí světla., Může také posunout vývoj nové generace organické architektury (29), kde budou geneticky modifikované zářící rostliny integrovány do budov a městské infrastruktury. Kromě toho, se svou zajímavou evoluční historií, rodinou luciferáz a celkovou jednoduchostí, je zde prezentovaný houbový bioluminiscenční systém molekulárním hřištěm, které má řadu příležitostí pro základní a aplikovaný výzkum.,