fetální telecí sérum

fetální telecí sérum zbavené uhlí (viz také Ref. 3)

1

přidejte 250 mg dřevěného uhlí a 25 mg dextranu T-70 na 100 ml fetálního telecího séra (FCS).

2

inkubujte při 56°C po dobu 30 minut.

3

odstředivka při 3000-4000 ot / min po dobu 30 min při pokojové teplotě.

4

přeneste supernatant na čerstvé kbelíky.

5

Opakujte předchozí kroky.

6

filtrujte supernatant pomocí prefiltru (Typ AP; Millipore, Bedford, MA), abyste odstranili dřevěné uhlí.

7

filtrujte roztok přes 0.,45-μ m filtr velikosti pórů (Flowpore, 64-002-04; ICN Biomedicals, Ltd.).

8

uchovávejte alikvoty při -20°C.

želatina (10 × zásob)

1

Vytvořte 1% (w/v) roztok želatiny (G-2500; Sigma, St.Louis, MO)

2

autokláv po dobu 20 minut.

3

uchovávejte při 4°C.

nádobí/lahve potažené želatinou

1

zředte želatinu 10krát.

2

pipetujte tento roztok na nádobí, aby zcela pokryl povrch misky (1,5 až 2 ml na 6 cm misku).

3

nechte nádobí 2 hodiny při pokojové teplotě. Pro urychlení tohoto postupu mohou být umístěny v inkubátoru při 37°C po dobu 1 hodiny.,

4

nasajte nádobí.

5

zabalte nádobí do hliníkové fólie a uložte je při pokojové teplotě nebo při 4°c.

HEBS pufr (10× zásob)

1 2

přidejte dvojitou destilovanou vodu na 975 ml.

3

nastavte pH na 7, 05 a objem na 1000 ml.

4

Autoklávujte roztok a uchovávejte jej při 4°C.

5

před použitím se do pufru přidá filtrovaný roztok glukózy (viz Příprava 2× HEBS).

HEBS (2×)

1

zředí HEBS 10× zásob pětkrát sterilním H2O.

2

přidá se 0, 2 ml filtrovaného roztoku glukózy (1 g/ml) na 100 ml (konečná koncentrace, 10 mM).,

3

nastavte pH na 7,05–7,08. Tento krok je zásadní pro vytvoření komplexu Ca-DNA.

4

sterilizujte roztok filtrací.

fyziologický roztok pufrovaný fosfátem (PBS) bez vápníku a hořčíku (14200-067 M; GIBCO, Grand Island, NY)

CaCl2 (2,5 M)

média

normální médium: připravené s tepelně neaktivovanými FCS a médiem s fenolovou červenou

Steroid-depleted medium: připravené s FC a médiem zbaveným dřevěným uhlím bez fenolu red. Toto médium se používá pouze tehdy, má-li být testován účinek hormonů, obvykle přítomných v séru.,

Množství plasmidu na transfekci

Reportér plasmidový konstrukt, 6.5 µg

expresního vektoru, 1.0 µg

Výraz plazmidu pro transfekci účinnost, 0,5 µg

Když celkové množství DNA je méně než 8 až 10 µg, nosič DNA (plasmid nebo herring sperm DNA) by měly být přidány s cílem získat dobrou Ca–DNA sraženina

Lysis buffer

Leave a Comment