fetální telecí sérum zbavené uhlí (viz také Ref. 3)
1
přidejte 250 mg dřevěného uhlí a 25 mg dextranu T-70 na 100 ml fetálního telecího séra (FCS).
2
inkubujte při 56°C po dobu 30 minut.
3
odstředivka při 3000-4000 ot / min po dobu 30 min při pokojové teplotě.
4
přeneste supernatant na čerstvé kbelíky.
5
Opakujte předchozí kroky.
6
filtrujte supernatant pomocí prefiltru (Typ AP; Millipore, Bedford, MA), abyste odstranili dřevěné uhlí.
7
filtrujte roztok přes 0.,45-μ m filtr velikosti pórů (Flowpore, 64-002-04; ICN Biomedicals, Ltd.).
8
uchovávejte alikvoty při -20°C.
želatina (10 × zásob)
1
Vytvořte 1% (w/v) roztok želatiny (G-2500; Sigma, St.Louis, MO)
2
autokláv po dobu 20 minut.
3
uchovávejte při 4°C.
nádobí/lahve potažené želatinou
1
zředte želatinu 10krát.
2
pipetujte tento roztok na nádobí, aby zcela pokryl povrch misky (1,5 až 2 ml na 6 cm misku).
3
nechte nádobí 2 hodiny při pokojové teplotě. Pro urychlení tohoto postupu mohou být umístěny v inkubátoru při 37°C po dobu 1 hodiny.,
4
nasajte nádobí.
5
zabalte nádobí do hliníkové fólie a uložte je při pokojové teplotě nebo při 4°c.
HEBS pufr (10× zásob)
1 2
přidejte dvojitou destilovanou vodu na 975 ml.
3
nastavte pH na 7, 05 a objem na 1000 ml.
4
Autoklávujte roztok a uchovávejte jej při 4°C.
5
před použitím se do pufru přidá filtrovaný roztok glukózy (viz Příprava 2× HEBS).
HEBS (2×)
1
zředí HEBS 10× zásob pětkrát sterilním H2O.
2
přidá se 0, 2 ml filtrovaného roztoku glukózy (1 g/ml) na 100 ml (konečná koncentrace, 10 mM).,
3
nastavte pH na 7,05–7,08. Tento krok je zásadní pro vytvoření komplexu Ca-DNA.
4
sterilizujte roztok filtrací.
fyziologický roztok pufrovaný fosfátem (PBS) bez vápníku a hořčíku (14200-067 M; GIBCO, Grand Island, NY)
CaCl2 (2,5 M)
média
normální médium: připravené s tepelně neaktivovanými FCS a médiem s fenolovou červenou
Steroid-depleted medium: připravené s FC a médiem zbaveným dřevěným uhlím bez fenolu red. Toto médium se používá pouze tehdy, má-li být testován účinek hormonů, obvykle přítomných v séru.,
Množství plasmidu na transfekci
Reportér plasmidový konstrukt, 6.5 µg
expresního vektoru, 1.0 µg
Výraz plazmidu pro transfekci účinnost, 0,5 µg
Když celkové množství DNA je méně než 8 až 10 µg, nosič DNA (plasmid nebo herring sperm DNA) by měly být přidány s cílem získat dobrou Ca–DNA sraženina
Lysis buffer