antagonismus mezi penicilinem a erythromycinem proti Streptococcus pneumoniae in vitro a in vivo

Abstrakt

kombinace β-laktamových antibiotik a makrolidů se často doporučuje pro počáteční empirickou léčbu akutní pneumonie za účelem získání aktivity proti nejdůležitějším patogenům. Teoreticky může být tato kombinace neúčinná, protože bakteriostatické činidlo může antagonizovat účinek baktericidního činidla., V této studii byla možná interakce mezi penicilinem a erythromycinem zkoumána in vitro a in vivo proti čtyřem klinickým izolátům Streptococcus pneumoniae s mikrofony penicilinu v rozmezí od 0, 016 do 0, 5 mg / L a erythromycinu od 0, 25 do >128 mg/L. in vitro byly vytvořeny křivky s klinicky relevantními koncentracemi penicilinu (10 mg / L) a erythromycinu (1 mg / L), a to buď jednotlivě, nebo v kombinace. Antagonismus mezi penicilinem a erythromycinem byl pozorován u čtyř izolátů., Interakce in vivo byla zkoumána v modelu peritonitidy myši. Po intraperitoneální inokulaci byly penicilin a erythromycin podávány buď jednotlivě nebo v kombinaci. U dvou ze čtyř izolátů byla úmrtnost významně vyšší ve skupinách léčených kombinací penicilinu a erythromycinu než ve skupinách léčených samotným penicilinem . Pomocí modelu peritonitidy myši ukázaly křivky in vivo time–kill, že mezi erythromycinem a penicilinem existuje antagonismus pro vyšetřovaný izolát., Antagonismus prokázaný in vitro a in vivo mezi penicilinem a erythromycinem naznačuje, že β-laktamová antibiotika a makrolidy by neměly být podávány společně, pokud není vyloučena pneumokoková infekce.

Úvod

je výzvou zvolit správnou terapii u pacientů s pneumonií, protože etiologii nelze předvídat na základě samotných příznaků a klinických nálezů a konečná mikrobiologická diagnóza obvykle nebyla stanovena před zahájením léčby., Streptococcus pneumoniae je nejčastěji izolovaným organismem v komunitní pneumonii, zejména u malých dětí a starších pacientů, a infekce stále nese vysokou úmrtnost.1 infekce Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae a Legionella spp. jsou také běžné2, 3 a tyto organismy obvykle nejsou citlivé na antimikrobiální látky běžně používané k léčbě pneumokoků. Proto se penicilin nebo jiné β-laktamy často doporučují v kombinaci s erythromycinem pro počáteční empirickou léčbu akutní pneumonie neznámé etiologie.,4

Dříve, in vitro a in vivo synergie mezi β-laktamová antibiotika, jako jsou penicilin, ampicilin, piperacilin a cefuroxim, byla prokázána při kombinaci s gentamicin proti S. pneumoniae.5,6 antagonismus in vitro byl prokázán pro kombinace, jako je ampicilin a chloramfenikol proti Haemophilus influenzae7 a proti streptokokům skupiny B.,8 klinicky důležitý antagonismus byl hlášen mezi penicilinem a tetracyklinem proti pneumokokům, 9, 10 penicilinu a erythromycinu proti streptokokům skupiny A11 a ampicilinu, streptomycinu a chloramfenikolu při akutní bakteriální meningitidě.12 teoreticky může být empirická počáteční léčba pneumonie kombinací β-laktamového činidla a makrolidu také neúčinná v případě pneumokokové infekce, protože bakteriostatický makrolid může antagonizovat baktericidní účinek β-laktamu.,

v této studii jsme zkoumali možnou interakci mezi penicilinem a erythromycinem in vitro proti čtyřem klinickým izolátům pneumokoků s různými náchylnostmi k penicilinu a erythromycinu.6,13 studovali jsme interakce in vivo v modelu peritonitidy myší.6

materiály a metody

bakterie, média a podmínky růstu modelu peritonitidy myší

bakteriální suspenze, které se používají jako inokula pro testy in vitro a in vivo, byly připraveny z čerstvých jednodenních kultur na 5% krevních agarových deskách vyrobených ze zmrazených zásobních kultur., Inokulum pro myší experimenty byl připraven bezprostředně před očkováním pozastavením kolonií ve sterilním vývaru Mueller-Hinton (Statens Serum Institut, Kodaň, Dánsko) a byl upraven na optickou hustotu při 540 nm 0,5–1,0, což dávalo koncentraci c. 108 cfu/mL, jak bylo popsáno výše. 13 pro každý experiment byla velikost inokula stanovena po provedení 10násobného ředění v Mueller-Hintonovém vývaru, z nichž 20 µL bylo pokoveno na dvou 5% krevních agarových deskách ve dvojím místě, s následným počítáním kolonií po inkubaci přes noc při 35°C ve vzduchu., Mucin (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA), enzymový extrakt z prasečího žaludku, byl použit jako adjuvans pro inokulaci myší a byl připraven jako zásobní roztok 10% (w/V) ve fyziologickém roztoku.13 Bezprostředně před očkováním, mucin roztoky byly naředěny 1:1 s pneumokokovou suspenze, který vydává konečné mucin koncentraci 5% (w/v).

užívané léky byly penicilin G (Leo Pharmaceutical Co., Ballerup, Dánsko) a erythromycin (Sigma Chemical Co.). Penicilin G byl zředěn ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem pH 6,5 ± 0.,1 a erythromycin byl zředěn v 9 mL sterilní vody a 1 mL 96% alkoholu; pH roztoku erythromycinu bylo upraveno na 6, 7 až 7, 3.

mikrofony a Mbcs

mikrofony byly určeny metodou makrodiluce vývaru ve skleněných trubkách. Všechny testy byly provedeny ve dvou vyhotoveních a výsledky byly přečteny po 20 hodinách inkubace při 35°C.metoda bujónového makrodiluce ve skleněných tubách byla provedena s Mueller–Hintonovým vývarem (Statens Serum Institut), ke kterému bylo přidáno 5% ovčí krve; bylo použito inokulum 106 cfu/ml., Penicilin G byl zředěn ve dvou krocích v Mueller-Hintonovém vývaru, aby se dosáhlo koncentrace 0,004-64 mg / l. nejnižší koncentrace antibiotika, při které nedošlo k viditelnému růstu, byla přijata jako MIC. Použili jsme s. pneumoniae ATCC 49619 jako kontrolní kmen pro MIC testy.

MBC byla určena subkulturou trubek bez viditelného růstu po stanovení MIC. Z každé zkumavky bylo 100 µL kultivováno na agarových deskách obsahujících penicilinázu (Leo Pharmaceutical Co.) 1000 IU/talíř a kolonie byly počítány po inkubaci 18-24 h při 35°C., MBC byla definována jako nejnižší koncentrace penicilinu, která snížila inokulum o ≥99, 9%. Všechny testy byly provedeny ve dvou vyhotoveních.

křivky Time–kill

pro studium možných interakcí mezi penicilinem a erythromycinem byly provedeny experimenty time-kill s klinicky relevantními koncentracemi penicilinu a erythromycinu 10 a 1 mg / l., Před časem–zabít experimenty, izolovat 86 (erythromycin rezistentní) se pěstuje na 5% krevní agar desky obsahující erythromycin 4 mg/L (indukce erytromycin rezistence) a na deskách bez erytromycin (ne indukce erytromycin rezistence). Pneumokoky (106 cfu/mL) byly inkubovány ve 20 mL vývaru Mueller–Hinton při 35°C při třepání. Pro zajištění exponenciálního růstu bakterií byla antibiotika poprvé přidána po 1 hodině inkubace. Vzorky byly odebrány před přidáním antibiotik a o 1, 2, 3 a 5 h později., Křivky zabíjení času nebyly dále prodlouženy, protože autolýza se začala vyskytovat po 5-6 h pro všechny izoláty. Počet cfu / mL byl stanoven po provedení vhodných ředění a 100 µL bylo rozloženo na 5% krevních agarových destiček. Pro nezředěné vzorky byly použity agarové desky obsahující penicilinázu (jak je uvedeno výše). Kolonie byly počítány po 20 h inkubace při 35°C. všechny pokusy s časovým zabitím byly prováděny ve dvou vyhotoveních. Změna počtu kolonií ve stejných časových bodech pro opakované experimenty byla <0,5 log10 na ml., >0, 5 log10 cfu / mL od 1 do 5 h po přidání léků) kombinace penicilinu a erytromycinu ve srovnání se samotným penicilinem.14

v experimentech s časovým zabitím jsme měřili možné změny pH v baňkách pomocí pH testovacích proužků (rozsah pH 4.5 – 10.0; odstupňované v jednotkách 0.5 pH; Sigma Chemical Co.).

pokusy na zvířatech (model peritonitidy myší)

všechny pokusy na zvířatech byly schváleny dánským národním etickým výborem pro zvířata., Outbred samice ssc CF-1 myši (Statens Serum Institut) ve věku 8-12 týdnů, hmotnost 28-30 g byly použity, ve skupinách po pěti až 36 myší. Celkově jsme použili 88 myši pro izolaci 73, 89 myši pro izolaci 75, 88 myši pro izolaci 86 (bez indukce), 94 myši pro izolaci 86 (vyvolané s erytromycinem jako pro čas–zabít studií) a 89 myši pro izolaci 93. Myši byly drženy v klecích s pěti až sedmi myší na klec; měli volný přístup k potravě a vodě. Pneumokoková suspenze (0, 5 mL) byla naočkována intraperitonálně pomocí injekční stříkačky o rozměru 25., Inokulum obsahovalo 106 cfu/mL s 5% (w/v) mucin v Mueller–Hinton bujón. Při použití takové inokuly existuje c. 100% úmrtnost u neléčených myší, které po inokulaci podlehnou 36-48 h. Antibiotika byla podávána subkutánně v oblasti krku v objemu 0, 25 mL na dávku.13 byl použit následující plán: erythromycin byl podán 90 min po bakteriální inokulaci a v kombinované skupině erythromycin byl podán 90 min po bakteriální inokulaci a penicilin 60 min později. Penicilin byl podáván samostatně 150 min po bakteriální inokulaci., Kontrolní myši dostaly sterilní fyziologický roztok 90 min po bakteriální inokulaci.

dávky penicilinu a erythromycinu byly zvoleny podle křivek sigmoidního dávkového efektu Hillovy rovnice tak, aby samotný penicilin měl za následek přežití c. 95%, zatímco samotný erythromycin měl zabránit úmrtnosti u 10% myší. Myši infikované izolátem 73 byly léčeny penicilinem 10 mg / myš a / nebo erythromycinem 100 µg/myš. Myši infikované izolátem 75 byly léčeny penicilinem 2 mg / myš a / nebo erythromycinem 100 µg/myš., Myši infikované izolátem 86 (indukované) byly léčeny penicilinem 150 µg / myš a / nebo erythromycinem 100 µg/myš. Myši infikované izolátem 86 (pěstované v přítomnosti sub-inhibičních koncentrací erythromycinu před inokulací) byly léčeny penicilinem 150 µg/myš a/nebo erythromycinem 100 µg/myš. Myši infikované izolátem 93 byly léčeny penicilinem 400 µg / myš a / nebo erythromycinem 100 µg/ myš.

vzorky krve byly získány orbitálními řezy po anestezii myší CO2., Myši byly zabity a peritoneální výplachy byly poté provedeny injekcí 2 mL sterilního fyziologického roztoku intraperitonálně, masírováním břicha a otevřením peritonea pro sběr tekutiny.15 vzorků krve a peritoneální tekutiny bylo okamžitě zředěno a 0, 1 mL bylo pokoveno na 5% krevních agarových desek.

křivky In vivo time–kill byly konstruovány pro jeden z izolátů pneumokoků (číslo 93), který vykazoval významný antagonismus in vivo. Pneumokoky v pobřišnice a krve byly získány po naočkování 36 myši intraperitoneálně s 5.0 × 106 cfu/mL bakteriální suspenze., Deset minut, 80 min, 140 min, 3 h a 5 h po výzvě byly zabity skupiny tří kontrolních myší (naočkovaných sterilním fyziologickým roztokem). Po 140 min, 3 h a 5 h po výzvě byly skupiny tří myší léčených erythromycinem 90 min po výzvě zabity. Při 3 h a 5 h po výzvě byly skupiny tří myší léčených buď kombinací penicilinu a erythromycinu nebo samotného penicilinu 150 min po intraperitoneální infekci zabity. Krevní a peritoneální výplachy byly odebrány vzorky pro kvantitativní kulturu pneumokoků.,

Stanovení ED50 penicilinu pro jednotlivé pneumokoky

ED50, jedna dávka poskytuje ochranu na 50% myší, pro každý pneumokokům izolovat byla určena léčbě skupin po pěti myší s zdvojnásobení dávky antibiotik; přežití myší byla pozorována po dobu 7 dnů. Skupina pěti myší léčených 0, 9% NaCl byla zařazena do každého experimentu jako kontrola letality infekce. Pro každý izolát byl ED50 vypočítán metodou Reed & Muench16 A Z Hill equation (GraphPad Prism; GraphPad Software, Inc.,, San Diego, CA, USA). Neprováděli jsme žádné experimenty s cílem vypočítat Erythromycin ED50s, protože to bylo dříve provedeno pro kmeny s podobnými mikrofony v naší laboratoři.17 vybrali jsme dávky penicilinu, které by měly mít za následek odhadované 95% přežití dávek myší a erythromycinu, které by měly mít za následek odhadované 10% přežití myší. Pro kombinovanou terapii byla antibiotika podávána v samostatných injekcích.

Statistika

Fisherův přesný test kategorických dat byl použit s oboustrannou 5% úrovní významnosti.,

výsledky

mikrofony penicilinu a erythromycinu a ED50s penicilinu pro čtyři pneumokokové kmeny jsou uvedeny v tabulce. Smrtící infekce byla dosažena třemi ze čtyř izolátů. ED50 penicilinu pro izolát 86 však musel být odhadnut, protože bylo možné dosáhnout pouze 90% úmrtnosti v experimentech stanovení ED50.

výsledky experimentů s časovým zabitím jsou uvedeny na obrázku 1., Touto metodou vykazovaly všechny izoláty antagonismus in vitro pro kombinaci penicilinu a erythromycinu (obrázek 1a–c A e), protože erythromycin téměř zcela inhiboval baktericidní účinek penicilinu. Nicméně, když byla rezistence na erythromycin indukována zvýšením izolátu rezistentního na erythromycin (číslo 86) na krevních agarových deskách obsahujících erythromycin 4 mg/L před studií time–kill, antagonismus erythromycinu byl neutralizován (obrázek 1D).

U všech izolátů, se in vitro smrtící účinek penicilinu a penicilin plus erythromycinu zvyšuje s časem., Pokles cfu pozorovaný v kontrolních baňkách v některých experimentech byl způsoben autolýzou, běžným pozorováním u pneumokoků. Ve všech experimentech vykazoval samotný erythromycin menší zabíjecí účinek než penicilin a kombinace. Během 5 hodin inkubace v kmeni rezistentním na erythromycin nebyl pozorován žádný zabíjecí účinek, ať už byl inkubován s erythromycinem nebo ne. V baňkách obsahujících jedno nebo obě antibiotika nebyly pozorovány žádné změny pH: pH bylo 7, 5 po 0, 1, 2, 3, 4 a 5 h inkubace.,

v modelu peritonitidy myší jsme zjistili, že kombinovaná léčba penicilinu a erythromycinu vedla k antagonismu u myší napadených izoláty 75 a 93 (obrázek 2B a e). Tam byl výrazně vyšší úmrtnost u myší léčených erytromycin 60 min před penicilin, než u myší léčených penicilinem sám (izolovat 75: úmrtnost 32/36 a 3/12, respektive P < 0.05; izolovat 93: úmrtnost 24/36 a 3/12, respektive P < 0.05) (Obr. 2)., U zbývajících dvou izolátů byla mortalita u myší podávaných oběma antibiotiky podobná jako u myší, kterým byl podáván samotný penicilin (obrázek 2a a d). Všechny kontrolní myši zemřely, když byly infikovány intraperitonálně pneumokoky, s výjimkou myší infikovaných izolátem 86, u nichž byla úmrtnost 80-90%. Dokonce i když bylo bakteriální inokulum izolátu 86 zvýšeno na 108 cfu/mL, nedošlo k 100% úmrtnosti.

nejnižší úmrtnost byla zjištěna u těch skupin myší léčených samotným penicilinem nebo erythromycinem plus penicilinem v kombinaci po bakteriální výzvě., Nejvyšší úmrtnost byla pozorována u kontrolních myší nebo myší léčených samotným erythromycinem 90 min po pneumokokové infekci (Obrázek 2). Pro izolaci 86 zjistili jsme, že kombinovaná léčba za předpokladu, výrazně lepší ochranu proti pneumokokové infekci než léčba penicilin sám po 150 min (32/35 myši v bývalé skupiny přežil ve srovnání s 6/12 v druhé; P = 0.009) nebo erythromycin sám (32/35 a 16/36 přežití, respektive; P = 0.005) (Obrázek 2c)., Když byla rezistence na erythromycin indukována před očkováním izolátem 86, kombinovaná léčba poskytla výrazně lepší ochranu než samotný erythromycin (31/36 myší v bývalé skupině přežilo ve srovnání s 5/36 v druhé skupině; P = 0, 005).

křivky in vivo time–kill pro izolát 93 vykazovaly 1-2 log zvýšení růstu bakterií v krvi 80 min po výzvě ve srovnání s 10 min po výzvě u kontrolních myší (obrázek 3), zatímco počet pneumokoků v peritoneálních mycích po 80 min byl stejný jako počet 10 min po očkování., Počet pneumokoků kultivovaných z krve a peritoneálních výplachů v různých časových bodech v různých léčebných skupinách byl téměř paralelní, přičemž 1-2 log vyšší cfu / mL v peritoneálních mycích než v krvi. Zabíjení bakterií bylo nejúčinnější ve skupině léčené penicilinem, s poklesem bakteriálního růstu o 3 protokoly a 4 protokoly v krvi a peritoneální výplachy. Kombinovaná terapie vykazovala podobný účinek na růst bakterií jako při podávání samotného erythromycinu (antagonismus).,

diskuse

interakce mezi erythromycinem a penicilinem proti pneumokokům byla studována se čtyřmi izoláty s různou náchylností k penicilinu nebo erythromycinu. In vitro čas–zabít křivky pro erythromycin-citlivý izolát (Obrázek 1a, b a e) ukázal jasné nepřátelství mezi dvěma léky, tj. přítomnosti erythromycinu zcela inhibuje baktericidní účinek penicilinu a výsledná křivka byla podobná pomalý inhibiční aktivitu erytromycin sám., Inhibice účinku penicilinu (který je kyselý) mohla být způsobena zvýšením pH způsobeným erythromycinem (který je alkalický). Měření pH v baňkách s kombinací léčiv však neprokázalo žádné změny pH. antagonistický účinek byl pozorován také u neindukovaného pneumokokového izolátu rezistentního na erythromycin (86), zatímco indukce exprese genu rezistence na erythromycin zabránila inhibičnímu účinku erythromycinu a jeho antagonistické aktivitě na penicilin., Tyto výsledky jasně ukazují, že je inhibiční aktivitu makrolidová na růst nebo dělení buněk z bakterie, která je hlavní důvod pro nepřátelství vůči penicilinu, které mohou působit pouze na bakterie, které jsou ve fázi růstu a produkci buněčné stěny.15 tato bakteriostatická aktivita erythromycinu a jeho inhibiční účinek na penicilin byly jasně patrné v experimentech in vivo.,

abychom mohli vyhodnotit možnou interakci mezi oběma léky in vivo, vybrali jsme model myse peritonitis,který byl dříve užitečný při demonstraci interakce mezi antibiotiky, 6 a který také umožňuje studovat působení léků na bakterie prováděním in vivo časově zabíjejících experimentů na organismech v peritoneu a/nebo krvi.17 Dávky penicilinu a erytromycinu byly vybrány na Kopci rovnice esovité dávka–účinek křivky, a to takovým způsobem, že penicilin sám by se očekávat, že výsledek v c., 95% přežití, zatímco samotný erythromycin by byl schopen zabránit úmrtnosti pouze u 10% myší. Při těchto dávkách by účinek dávky erythromycinu bez vlivu následné dávky penicilinu vedl k mortalitě stanovené pouze aktivitou makrolidu. Antagonistická aktivita obou léčiv byla následně potvrzena časovými křivkami in vivo, které byly způsobeny stejnou aktivitou erythromycinu inhibující růst, jak bylo prokázáno in vitro., Význam indukce erytromycin rezistence na erytromycin-rezistentní izolát (číslo 86) byl prokázán i in vivo: indukční s erythromycin významně snížila přežití navzdory erythromycin léčba ve srovnání s přežitím po erythromycin léčba uninduced pneumokoky.

s jedním izolátem citlivým na erythromycin (číslo 73) nebylo možné prokázat antagonismus in vivo pomocí použité metody. Může to být několik vysvětlení., Možnost, že ne všechny pneumokoky reagují podobným způsobem jako obě užívané léky, se zdá nepravděpodobná, zejména pokud byla aktivita in vitro stejně prokazatelná. Je pravděpodobnější, že se situace in vivo liší u různých kmenů, např. virulence pneumoccci závisí na řadě faktorů, které je obtížné standardizovat, jako je typ a velikost kapsle, další virulenční faktory spojené s membránou nebo toxiny nebo růstové chování in vivo, které je pro pneumokoky velmi variabilní., Je pravděpodobné, že bychom mohli mít prokázán antagonismus in vivo se izolovat 73 pokud bychom měli ‚titruje‘ inokula a načasování těchto dvou drog ve vztahu k sobě navzájem, ale to by vyžadovalo příliš velký počet zvířat., Jasná demonstrace interakce mezi těmito dvěma léky proti nejméně dvěma pneumokokovým kmenům Jak in vitro, tak in vivo, což bylo prokázáno zvýšením úmrtnosti, jakož i změnami v křivkách in vivo time–kill, je dostatečným důkazem účinku a měla by varovat lékaře před použitím těchto dvou léků společně k léčbě pneumokokových infekcí.

klinický význam antagonismu mezi baktericidním léčivem, jako je penicilin nebo ampicilin, a inhibitorem syntézy bakteriostatických proteinů, např., tetracyklin, erythromycin nebo chloramfenikol byl prokázán v několika studiích.7-12, 18 antagonismus byl potvrzen in vivo v experimentální studii s penicilinem a chloramfenikolem proti pneumokokové meningitidě u psů.19 navzdory této rané zkušenosti s takovými kombinacemi léků se kombinace penicilinu a erythromycinu doporučuje i ve standardních učebnicích jako empirická léčba pneumonie neznámé etiologie.4 kombinace léků je zvláště zvolena tak, aby zahrnovala pneumokoky a Legionella spp.,, které jsou považovány za důležité a smrtící etiologické látky při pneumonii. Je obtížné zjistit, zda jsou výsledky této studie přímo použitelné pro klinickou situaci. V klinické situaci by se obvykle nepoužívaly suboptimální dávky erythromycinu, ale s inhibovaným účinkem penicilinu se může spoléhat na bakteriostatický účinek erythromycinu, pokud je pneumokok náchylný k erythromycinu. Není známo, zda indukovatelný účinek erythromycinu prokázaný v této studii probíhá také v pneumonickém zaměření u lidí.,na závěr tato studie prokázala antagonismus mezi penicilinem a erythromycinem proti třem izolátům pneumokoků citlivým na erythromycin in vitro. K tomuto antagonismu došlo také u dvou izolátů in vivo v jednoduchém experimentálním modelu s myší. Pokud nebyla indukována rezistence na erythromycin, byl in vitro prokázán antagonismus pro pneumokokový izolát rezistentní na erythromycin, ale indukce erythromycinem před inokulací zničila antagonistický účinek.

odborná technická pomoc Anja Borum a Jytte Mark Andersen je velmi ceněna., Předběžné údaje předložené v konečné podobě v tomto rukopisu byly prezentovány na třicáté sedmé konferenci Interscience o antimikrobiálních látkách a chemoterapii, Toronto, Ontario, Kanada, 28.září–1. října 1997 (plakát A-29).